2008―2012奉化市成人麻疹临床分析和病毒基因特征研究.docVIP

2008―2012奉化市成人麻疹临床分析和病毒基因特征研究 　　摘要：目的：应用分子生物学方法检测奉化市2008-2010年成人感染麻疹病毒，分析麻疹病毒基因特性，了解成人麻疹的发病原因，为麻疹监测和防治提供依据。方法：收集100例成人麻疹患者的咽拭子和血清，应用逆转录-聚合酶链反应扩增麻疹野毒株的核蛋白（N）基因碳末端的456个核苷酸并进行核苷酸序列测定，与基因库中按照病毒各基因型参考株比较并分析毒株变异情况。结果：奉化市成人麻疹临床表现典型，分离到的麻疹病毒均为H1基因型，与H1型参考株的核苷酸同源性为97.1%-98.0%，与中国疫苗株沪191的核苷酸/氨基酸差异为8.0-9.0%/9.8-14.5%。 　　关健词：成人麻疹 流行病学 病毒基因 资料与方法 　　基金项目：宁波市科技局计划项目（200901C4010039），国家“十一五”专项（2009ZX10601） 　　一、 研究对象 　　2008年1月-2012年6月在奉化市人民医院感染科住院或门诊共诊治的18岁以上成人麻疹患者100例。均经麻疹病毒IgM抗体检测阳性而确诊。在知情同意的情况下，由临床医生调查病人一般情况及病史等，并填写麻疹病毒流行病学调查表，同时收集病人咽拭子、血液标本，于采集后24小时内置冰袋送至实验室。实验室及时对样本作进一步的处理后保存于-70℃冰柜。 　　二、 方法 　　2.1、病毒RNA提取 　　取出三个样品（麻疹病毒不同分离株，-80℃冻存，取至上海分子病毒实验室）和一个标准株作阳性对照。麻疹减毒活疫苗沪191（取至上海疾控中心），采用德国QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit，按试剂盒说明书提取麻疹RNA 　　2.2、引物 　　研究所得麻疹病毒核蛋白（Nucleoprotein，N）基因片段扩增引物根据文献涉及，序列如下：MN5，5’-GCCATGGGAGTAGGAGTGGAAC-3’（1113-1134）；MN6，5’-CTGGCGGCTGTGTGGACCTG-3’（1737-1754）。产物进行1.5%琼脂糖凝电泳，在N基因碳末端的660bp处有一明显阳性带。所有检测至少重复2次。 　　2.3、逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR） 　　采用日本TaKaRa one step RNA PCR kit（AMV）试剂。取8ul麻疹病毒的RNA提取物作为模板，反应条件如下：50℃ 30min逆转录，94℃ 2min变性后，PCR循环如下：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，循环35周后，72℃延伸10min。扩增后产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 　　2.4、核苷酸序列测定及分析 　　扩增后产物送上海Invitrogen公司进行序列测定，测序结果的序列拼接、处理分析使用了DNA BSTAR软件，其余参比的代表株序列均来自基因库（GenBank）。 　　3结果 　　3.1、入组病例临床资料分析 　　2008年-2012年麻疹流行季节，奉化市人民医院共诊治麻疹抗体IgM阳性确诊的成人麻疹100例。病人年龄集中于18至58岁之间，年龄中位数为36岁。其中男性68例，女性32例。本市人口30例，外来流动人口70例。有30例曾有麻疹疫苗接种史，10例半月内有接种麻疹疫苗（40%），而60%（60/100）患者对是否种接过麻疹疫苗不详。全部病例均有发热，温度37.9℃-40.3℃不等，有88人（88.9%）为38.5℃以上高热。热型为稽留热，体温随皮疹消退而下降。热程在3-10天之间，其中无合并肺炎这热程在3-7天，合并有支气管肺炎者热程在6-10天，伴随有卡他症状者88例，占88.9%。出现眼结膜充血症状的有96例，占97.0%。出现口腔 Koplic斑的有94例。占94.9%。除了发热和斑丘疹外，伴随的其他症状还有恶心、呕吐7例，占7.1%，胸闷、心悸7例，占7.1%，腹痛、腹泻16例，占16.2%。 　　白细胞在2.5-13.6×109/L，≤ 4×109/L以下的有94例，占94.9%， 5例白细胞≥10×109/L，合并有肺炎。肝功能异常者有65例，占65.7%，为轻度异常，ALT≤（谷丙转氨酶）118U/L。心电图提示有ST段改变的有13例，占13.1%，有窦性心动过速的有8例，占8.1%。尿常规异常28例，其中尿蛋白阳性21例，潜血阳性17例，肾功能肌酐、尿素氮升高8例，为轻度异常。 　　3.2、基因亲圆形关系树 　　将所测得的3株麻疹野病毒N基因碳末端的456bp核苷酸序列与Genebank中麻疹病毒各基因型参考株进行比对，明确本研究中分离到的3株麻疹病毒基因型均为H型，与