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广藿香不同部位总DNA提取方法比较和PTS基因克隆 　　摘要：分别采用PEX法、CTAB法和SDS法3种方法提取广藿香叶、茎、根的基因组总DNA，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总DNA提取效果。结果表明，SDS法能高效一致地提取广藿香根、茎、叶的总DNA。以叶总DNA为模板，通过PCR技术扩增广藿香醇合成酶（PTS）基因，测序得到PTS基因（中国广藿香）的全长序列，长度为3 058 bp，包括7个外显子和6个内含子，共编码552个氨基酸。该PTS基因所推导的氨基酸序列与GenBank中已登录的印度广藿香PTS氨基酸序列存在4.7%的差异。 　　关键词：广藿香；总DNA；广藿香醇合成酶；克隆 　　中图分类号： S567.21+9.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0081-04 　　收稿日期：2015-01-30 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；海南省中药现代化专项（编号：2012ZY015）。 　　作者简介：陈英（1990―），女，贵州遵义人，硕士研究生，从事南药种质资源与活性成分研究。E-mail：814006138@。 　　通信作者：吴友根，博士，副教授，硕士生导师，从事南药种质资源与活性成分研究。E-mail：ccyyccii@163.com。纯度高、质量好的DNA是开展分子生物学研究的基础，是分子遗传学试验成功与否的关键因素之一[1]，植物总DNA的纯度还是影响PCR反应的限制因素之一[2]。由于不同植物、甚至同一植物的不同部位，其代谢产物的种类和含量不同，尤其是多糖、多酚和蛋白质等，很难找到一种高质量DNA提取的通用方法[3-4]。因此对植物总DNA提取方法进行比较分析、改进，以获得高质量的植物总DNA提取方法极为重要。广藿香[Pogostemon cablin （Blanco） Benth.]为唇形科刺蕊草属一年生草本植物，以干燥的地上部分入药，是我国常用的芳香化湿类中药之一，常用于治疗湿浊中阻、脘痞呕吐、寒湿闭暑、暑湿倦怠、腹痛吐泻、鼻渊头痛、胸闷不舒等疾[5]。百秋李醇（又名广藿香醇），是一种存在于天然植物中的三环倍半萜化合物，广泛应用于药品、食品及日用化妆品行业，是广藿香挥发油的主要成分之一，被历版《中华人民共和国药典》规定用作评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分。百秋李醇的生物合成途径类型与青蒿素的合成途径相同，属于类异戊二烯代谢途径中的倍半萜类分支途径。广藿香醇合成酶（patchoulol synthase，PTS）被认为是百秋李醇合成调控的关键酶[6]。2006年，Deguerry等从印度广藿香中克隆得到了PTS基因的cDNA及DNA序列[6]；2014年，Hartwig等从印度另一栽培居群的广藿香中克隆得到了PTS基因的cDNA序列，其编码的氨基酸序列与之前报道的cDNA序列所编码的氨基酸序列存在3.4%的差异[7]。中国广藿香作为一种独立栽培居群的广藿香，其PTS基因序列与之前报道的印度广藿香是否存在差异，目前尚未见报道。因此，本试验选用3种常用的DNA提取方法，比较其对广藿香根、茎、叶3个部位的提取效果，并以DNA为模板进行PTS基因的PCR扩展并克隆，比较克隆得到的基因序列及其编码的氨基酸序列与之前报道的印度广藿香的异同，为广藿香PTS基因的进一步利用奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　供试的广藿香植物材料采于海南大学园艺园林学院广藿香资源圃，采集生长期为5个月的广藿香叶、茎、根，采后用液氮冷冻处理，-80 ℃保存，备用。 　　试验所用的主要试剂有SDS（十二烷基磺酸钠）、CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）及PEX（乙基磺原酸钾）（北京鼎国公司），Taq DNA聚合酶、pMD19-T载体、感受态细胞（上海生物工程有限公司），其余试剂均为进口或国产分析纯，引物合成及测序由北京诺赛基因组研究有限公司完成。 　　1.2方法 　　1.2.1DNA提取采用PEX法、CTAB法及SDS法[8-10]分别提取广藿香根、茎、叶的基因组总DNA。 　　1.2.2DNA质量与浓度检测取5 μL提取的广藿香各部位总DNA溶液于0.8%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳，检测DNA的完整性。并取1 μL DNA样品，用无菌水稀释50倍，用紫外分光光度计检测D260 nm、D280 nm，并计算D260 nm/D280 nm，以确定其纯度及得率。 　　1.2.3PTS基因PCR扩增根据Genbank中登录的PTS基因的DNA序列，设计全长引物用于广藿香PTS基因的扩增，引物序列如下：正向引物5′-ATGGAGTTGTATGCCCAAAG-3′；反向引物5′-TTAATATGGAACAGGGTGAA-3′。P