草珊瑚和金粟兰叶片双位点特异性PCR鉴别方法研究.docVIP

草珊瑚和金粟兰叶片双位点特异性PCR鉴别方法研究 　　[摘要] 筛选获得草珊瑚与金粟兰鉴别的特异位点并建立双位点特异性PCR方法，用于鉴别草珊瑚与金粟兰叶片以及两者的混杂品。采集不同产地的草珊瑚18份、金粟兰6份，所有样品提取总DNA，并对草珊瑚与金粟兰干燥叶片进行DNA提取。通过对其ITS片段进行扩增、测序，并搜索GenBank 数据库中收录的草珊瑚与金粟兰的ITS序列，进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物，构建多重PCR体系，并优化PCR条件，对草珊瑚与金粟兰叶片进行快速分子鉴定。构建了多重PCR鉴别体系，只经一个PCR反应，能扩增出草珊瑚580 bp的特异性鉴别条带及金粟兰470 bp的特异性片段，可快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片，并可判断相互是否混杂。使用双位点特异性PCR技术可以有效快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片，并可判断相互是否混杂。 　　[关键词] 草珊瑚； 金粟兰； 叶片；特异性PCR；分子鉴定 　　草珊瑚形态变异较大且与近缘植物形态极其相似，加之名称的交叉混杂以及资源的不足造成了误采、误用，出现了金粟兰、鱼子兰等与草珊瑚功效不尽相同的非药典收载的混淆品，特别是金粟兰，叶片最为相似，而且金粟兰具有一定的肝毒性[1]。近几年来，随着草珊瑚野生资源却逐渐减少，而草珊瑚相关药品与商品的不断开发利用，市场对草珊瑚的需求越来越大，草珊瑚药材已出现供不应求之势[2]。草珊瑚相关商品中时常混有原植物为同科金粟兰属的金粟兰等混淆品的越趋常见。 　　目前，草珊瑚与金粟兰的鉴别可从原植物的叶的形态与显微特征等传统手段进行一定程度的鉴定。但是叶片一旦干燥或经过加工，在实际运用中要通过叶片组织显微结构特征等传统方法进行准确鉴别存在一定难度，对观察者经验的要求较高，缺乏规范化标准化方法。而利用化学成分的分析进行鉴定，也及为繁琐，也难判断是否混杂。因此急需草珊瑚与金粟兰叶片，特别是干燥叶片的快速鉴定方法。 　　近几年，位点特异性PCR方法为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段。近几年又不少利用DNA分子遗传标记技进行中药材的分子鉴别方面的报道，位点特异性PCR方法已成功应用于陈皮、细叶藁、人参等中药材的真伪鉴别[3-5]。而国内报道多见利用特异引物PCR扩增某一特异条带的有无进行辨别，这种辨别方法虽然可以鉴别某一目标药材与其伪品的区别，但是一旦目标药材中混有伪品，就不能依靠单独的一条特异条带的有无进行鉴别。为实现目标药材与其伪品的快速鉴别，并判断是否混杂，以达到在相互混杂时可以快速、准确的鉴别，本研究通过扩增草珊瑚与金粟兰属的易混种ITS序列，并测序，结合GenBank 数据库中收录的序列，通过其ITS 序列差异分析，设计双位点特异的引物，建立多重PCR鉴别体系，为准确进行草珊瑚与金粟兰叶片及二者混合样品的鉴别提供快速检测方法。 　　1 材料 　　PCR仪（Eppendorf，型号5332），电泳系统（ 北京市六一仪器厂，型号DYY-12），低温冷冻离心机（Eppendorf，型号5810R），凝胶成像分析仪（BIO-RAD ChemiDoc XRS），微量移液器（Eppendorf）。 　　2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka公司），TransStartTopTaq DNA Polymerase（北京全式金公司），三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为国产分析纯。 　　本研究实验样品是由福建中医药大学梁一池教授鉴定并收集的采自不同产地的18批样品，为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra，集中种植于福建中医药大学时珍园。6份金粟兰Chloranthus spicatus则分别被鉴定并收集于福建中医药大学时珍园、漳州卫生职业学院与福建省热带作物科学研究所（表1）。 　　2 方法 　　2.1 草珊瑚基因组DNA的提取和纯化 采取样品的叶片，分成2份，1份进行干燥后进行基因组DNA的提取，1份直接进行基因组DNA的提取，采用本研究室改良的CTAB法提取草珊瑚叶片的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。然后对所提取的草珊瑚DNA进行纯化。 　　2.2 引物设计 选择ITS通用引物对草珊瑚、金粟兰样品进行PCR扩增并测序，获得24条序列；并于搜索GenBank 数据库中草珊瑚与金粟兰的DNA序列信息（AF280408.1；AF280411.1等），用ClustalX 2.1软件对所有序列进行多重比较，筛选草珊瑚与金粟兰的特异位点，根据引物设计的原则，通过特异位点设计草珊瑚与金粟兰的相互鉴别的特异引物。 　　2.3 通用引物ITSF-ITSR扩增ITS全长的PCR反应体系 扩增序列的通用反应体系： 总体积20 μL，其中包括10×buffer缓冲液2.0 μ