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珠美海棠叶片离体培养和植株再生 　　摘要：将珠美海棠试管苗叶片接种于附加NAA0.3mg?L-1和不同体积分数的6-BA(1.0-6.0mg?L-1)的MS培养基中进行离体培养，结果表明，6-BA为1.0-3.0mg?L-1的处理芽再生率为6.7％-31.8％，而根的再生率为26.7％-28.3％。6-BA为4.5和6.0mg?L-1处理芽再生率分别高达80.0％和60.0％，根的再生率小于5％。继代培养60d的珠美海棠试管苗叶片的芽再生率显著低于继代培养30d的叶片。采用横切主脉的叶片切伤方式，其切口处芽的再生率及整个叶片芽的再生率均显著高于纵切主脉两侧叶片、横切主脉两侧叶片及横剪主脉两侧叶片等切伤方式。 　　关键词：珠美海棠；叶片；离体培养；再生 　　中图分类号：$661.19　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)01-124-05 　　 　　珠美海棠(Mslus zumi)为苹果属落叶小乔木或灌木，原产于日本北部山区，是毛山定子和三叶海棠的野生杂交种，1976年引入我国，具有较强的抗逆能力，抗白粉病和黑星病，较耐涝，并具有很强的耐盐能力，在含盐量0.4％左右的土壤中能够正常生长与开花结果，可以作为盐渍地区的绿化树种和苹果砧木推广应用。利用珠美海棠的耐盐特性进行转基因耐盐植物的培育具有广阔前景。苹果叶片的间隙大，易由细胞诱导分化出不定芽，已被作为基因转移操作及体细胞诱变的理想受体材料，因此建立叶片离体高效再生体系就成为进行苹果遗传操作的一个重要环节。目前对苹果品种与砧木的叶片培养与植株再生已有许多研究，而对珠美海棠叶片培养的报道较少。李宝等探讨了不同氮源和碳源对珠美海棠叶片再生效果的影响，并认为培养基中的6-BA和NAA组合为2.5mg?L-1：0.25mg?L-1时的叶片再生效果最好，王艳等的研究结果则表明这一激素组合为3.0mg?L-1：0.3mg?L-1时叶片再生最好，2者虽然接近，但存在差异。从已有的研究看，苹果叶片培养的再生效果受培养基成分、外植体生理状态、接种方式及培养方式等多种因素的影响，从而影响到试验结果的重现性。因此，有必要从多方面深入探讨影响珠美海棠叶片培养的因素，以便为建立高效、稳定的珠美海棠叶片培养再生体系提供依据。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　以在附加6-BA0.5mg?L-1、蔗糖30g?L-1的MS培养基上继代培养的珠美海棠试管苗为试材，以附加30g?L-1蔗糖的MS培养基为基本培养基。 　　 　　1.1　不同体积分数的6-BA和NAA组合对珠美海棠叶片培养与植株再生的影响 　　在基本培养基中分别添加NAA0.3mg?L-1与不同体积分数的6-BA构成不同的激素组合，6-BA体积分数分别为1.0、2.0、3.0、4.5和6.0mg?L-1，培养基pH值调至5.9，用7.2g?L-1琼脂做培养基固化剂。在50mL三角瓶中加入25mL培养基，用棉塞封口，在0.11-0.12Mpa的压力下灭菌20min。 　　选用继代培养30d的珠美海棠试管苗为试材，并选择试管苗顶部1-4片展开叶接种。接种时先用剪刀垂直于主叶脉将叶片两侧各剪成2-3个剪口，剪口深至接近主脉，然后将叶片自叶柄剪下，叶背面朝下平铺于培养基表面。每个处理接种20个叶片为1次重复，重复3次。接种后在24.6-25.7℃下暗培养20d，然后在光强3000-4000lx、光周期14h／d、23-27℃条件下培养。培养14d后调查各处理愈伤组织发生状况，培养40d后调查各处理器官再生情况。调查指标中的芽(根)再生率等于再生芽(根)的叶片数与接种叶片数之比，再生芽(根)数等于再生芽(根)总数与再生芽(根)的叶片数之比。 　　 　　 　　 　　 　　1.2　试管苗继代培养时间对珠美海棠叶片培养中植株再生的影响 　　选择继代培养60d的珠美海棠试管苗叶片，接种于附加NAA0.3mg?L-1、6-BA4.5mg?L-1及蔗糖30g?L-1的MS培养基中，并以继代培养30d时剪取的珠美海棠叶片做对照。培养基灭菌方法、叶片剪取与接种方式均同试验1.1，每处理接种20枚叶片为1次重复，重复3次。接种后进行暗培养20d，而后转入光下培养20d，暗培养及光培养条件同试验1.1。暗培养与光培养结束后调查芽再生率与再生芽数，指标计算方法同前。 　　 　　1.3　叶片切伤方式对叶片再生能力的影响 　　以继代培养30d的珠美海棠试管苗叶片为试材，接种于附加NAA0.3mg?L-1、6-BA4.5mg?L-1及蔗糖30g?L-1的MS培养基中。接种时叶片的切伤方式设计为4种。横切主脉：在叶片主脉上横切3-4个切口；纵切两侧：在叶片主脉两侧叶片处纵切3-4个切口，不切断叶缘：横切两侧：在叶片主脉两侧叶