CⅢ1菌株胞外抗菌蛋白防治香蕉炭疽病的研究.docVIP

CⅢ1菌株胞外抗菌蛋白防治香蕉炭疽病的研究 　　摘　要：为明确红树内生细菌CⅢ-1菌株的抗菌蛋白对香蕉炭疽病的控制作用，采用平板对峙法结合显微观察测定其对致病菌的抑制活性，进行抗菌蛋白对香蕉炭疽病的防病试验，并测定了香蕉果实内丙二醛的含量及防御酶活性的变化。结果表明，CⅢ-1抗菌蛋白粗提液喷雾后立即接种香蕉炭疽病菌，处理8d后其防治效果达71.44％，10d后防效仍有56.67％；防病机制测定表明，(1)CⅢ-1抗菌蛋白对香蕉炭疽病菌的菌丝生长及分生孢子萌发等具有极强的抑制作用，处理后的病菌菌丝出现肿胀、膨大、成泡囊状畸形，分生孢子基本不萌发。(2)抗菌蛋白处理香蕉后，与对照比，抗菌蛋白处理的香蕉丙二醛(MDA)的含量较低，同时过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等活性也均有不同程度的变化。 　　关键词：香蕉；抗菌蛋白；炭疽病；生物防治；机制 　　中图分类号：$668.1　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2010)04-580-05 　　 　　香蕉是华南地区的大宗果品之一，其营养丰富甜滑香浓，深受人们的喜爱。炭疽病是危害香蕉生产的主要病害之一，严重影响蕉果质量与商品价值。而利用化学杀菌剂控制病害，会造成严重的污染及危害。我国政府一直对食品安全性高度重视，目前已禁止使用多种化学杀菌剂，而不使用或者少用化肥农药的绿色水果亦深受广大消费者欢迎，同时，国外贸易壁垒也迫使我国必须开发安全、无公害、高效的果蔬防腐保鲜剂。可见研制微生物防腐保鲜剂对减少果品中农药残留、保护环境、提高经济效益等多个方面都具有十分现实的意义。CⅢ－1菌株是本实验室从湛江红树植物木榄叶片中分离到的1株植物内生解淀粉芽孢杆菌，该菌产生的胞外抗菌蛋白，对多种动植物病原菌具有较强的拮抗性，且对辣椒青枯病具有较好的防治效果。我们以CⅢ-1菌株产生的抗菌蛋白为研究材料，对其防治香蕉炭疽病的作用及其机理进行研究，为海洋微生物用于香蕉采后病害的生物防治、保鲜制剂的研制与开发应用等提供理论与实践依据。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　菌株来源 　　供试CⅢ－1菌株：为本实验室从红树植物一木榄(Bruguieragymnorrhiza)叶片体内分离获得的内生海洋细菌，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amy-loliquefaciens)，该菌不仅对番茄青枯菌(Rdstoniasolanacearum)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和猪链球菌(Streptococcus suis)等多种动植物病原菌具有拮抗作用，而且证明其抗菌物质主要是蛋白类，且发现在33％硫酸铵饱和度下凝聚沉淀提取的菌株胞外蛋白液的抗菌活性最强。为此，研究以33％硫酸铵饱和度下凝聚沉淀提取的CⅢ-1菌株胞外抗菌蛋白液为材料，进行试验。供试病原菌香蕉炭疽菌(C.musae)为本实验室分离保存。 　　 　　 　　 　　 　　 　　1.2　供试培养基 　　PSA液体培养基，NA培养基，改良PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20.0g，蛋白胨5g，琼脂18g，水1000mL，pH自然)。 　　 　　1.3　抗菌蛋白的制备及浓度测定 　　挑取平板培养的CⅢ-1菌株单菌落，接种于PSA液体培养基。培养18h后，按4％接种于PSA液体培养基，25℃培养96h。将培养液在10000r?min-1条件下离心20min后取其上清液，并用孔径为0.22um滤膜过滤，用33％硫酸铵饱和度沉淀其蛋白，经透析，即为菌株抗菌蛋白提取液，于20℃冰箱保存备用。 　　可溶性蛋白的含量测定采用考马斯亮蓝显色法测定抑菌蛋白的浓度。通过蛋白标准曲线换算得到浓度。 　　 　　1.4　CⅢ-1抗菌蛋白防治香蕉炭疽病效果测定 　　选健康无病、果个均匀、发育期基本一致的蕉果，用自来水冲洗表面后，晾干，均匀涂抹抗菌蛋白液，单果分开放入塑料盆中，待果面液体自然晾干后立即喷雾接种香蕉炭疽病分生孢子悬浮液(浓度约106孢子?mL-1，28℃下保湿培养。以清水PBS缓冲液处理为对照，3d后调查发病情况。 　　 　　1.5　香蕉炭疽病病情指数分级标准 　　0级：无病斑；1级：果面有零星病斑，柄部开始变黑，果柄见极少量菌丝；2级：果面病斑较多，病斑数5～10，柄部基本变黑，出现白色菌丝；3级：果面有大量病斑，柄部全部变黑，出现红色孢子堆；4级：果面有大量病斑，柄部全部变黑，蕉果开始腐烂；5级：果面布满病斑，果体松软腐烂，果柄易折断。 　　 　　1.6　CⅢ-1抗菌蛋白对香蕉炭疽病菌菌丝生长的影响 　　将香蕉炭疽病菌接种在PDA平板培养基上，对峙点接CⅢ－1菌株抗菌蛋白提取液，培养出