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亲水交互的作用―反相二维液相色谱―串联质谱同时测定乳制品中20种抗生素残留 　　摘 要 建立了亲水作用-反相二维液相色谱-串联质谱测定乳制品中β-内酰胺、四环素、大环内酯、氨基糖苷、酰胺醇、喹诺酮和磺胺7类20种抗生素残留的方法。样品与C18和CN填料混合，进行基质固相分散萃取，以乙腈和水洗脱，洗脱液旋转蒸发至近干，残渣流动相溶解后分析。对样品前处理条件、色谱流动相、质谱参数进行了优化。各分析物回归方程的相关系数为0.9945～0.9998；以定量离子信噪比为3和10时所对应的样品中分析物浓度计算检出限和定量限，分别为0.10～2.40 μg/kg和0.33～7.92 μg/kg。奶粉和牛奶中添加水平25 μg/kg的加标回收率分别为72.5%～97.2%和70.1%～96.8%，相对标准偏差为4.2%～8.8%和3.7%～9.9%。本方法应用于实际样品测定，结果满意。 　　关键词 亲水交互作用色谱；二维液相色谱；抗生素；基质固相分散 　　1 引 言 　　抗生素具有抑制或杀灭细菌、真菌、螺旋体、支原体、衣原体等致病微生物的作用。广义的抗生素常常包括： β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类（Aminoglycosides， AGs）、酰胺醇类、喹诺酮类、磺胺类和多肽类【1，2】。作为常用的兽药，近年来抗生素常被多类混合添加在动物饲料中，以掩盖单个药物残留量超限的现象。因此，为保障食品安全，建立同时检测多类抗生素的方法意义重大。 　　AGs极性最强，采用反相液相色谱（RPLC）分离，几乎没有保留。在流动相中加入离子对试剂，通过中和电荷降低其极性后可进行RPLC分离，但会极大增加平衡时间，且不利于与质谱联机【3，4】。亲水交互作用色谱（HILIC）使用RPLC的流动相，可分离强极性有机物，能解决了AGs的分离问题【5，6】，且易与质谱联用【7】。由于AGs和其它类抗生素极性差异大，抗生素多残留分析的难点在AGs和其它类同时提取和检测，现有方法通常只涉及4～5类抗生素【8～12】，且AGs和其它类抗生素同时检测的方法鲜有报道。 　　本研究利用双三元高效液相色谱仪，外接1个可变流速泵，7条流路组成亲水交互作用与反相色谱二维液相色谱系统（HILIC-RPLC），经三段分离，串联质谱（Tandem mass spectrometry， MS/MS）检测，建立了乳制品中的7类20种抗生素同时分离、定性定量分析的方法。对HILIC-RPLC，前人也做过一些研究，但与本方法在目的和原理上有所差异。Jandera等讨论了HILIC与RP的正交性，得出二者不能完全正交的结论【14】；Wang等采用4个流路两段分离模式对12种亲水和13种亲脂的混合物进行了检测，但分析物不涉及抗生素，也未对HILIC和RP都有所保留的情况进行探讨【15】；Liang等则采用了离线HILIC-RPLC的方式【16】。本研究采用了HILIC-RPLC-MS/MS三段检测模式，并提出了混合基质固相分散（Mixed matrix solid phase dispersion， MMSPD）的样品前处理技术，较好地解决了7类抗生素同时提取并检测的难点，方法简便、快速、灵敏度高，满足国际社会食品法规的最大允许残留量要求。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Ultimate3000高效液相色谱仪（美国ThermoFisher公司），带DGP-3600SD泵，带十通阀和六通阀各1个；AXP Auxiliary Pump（美国ThermoFisher公司）；3200Qtrap质谱仪（美国AB Sciex公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士BCHI 公司）；Vortex Genius3型涡旋混匀器（德国IKA公司）；2034型真空泵（美国Welch公司）；VisiprepTM-DL固相萃取系统（美国Sepulco公司）6 mL SPE空管及配套熔融玻璃隔板（美国Agilent公司）；Chromatorex C18键合硅胶填料（40～75 μm，日本富士公司）；Cleanert 氰基（CN），硅胶（Silica），强阳离子（SCX）填料（平均粒度45 μm，美国Agela Technologies）。 　　头孢噻呋、氨苄青霉素、邻氯青霉素、大观霉素、链霉素、双氢链霉素、庆大霉素C1a、阿米卡星、卡那霉素、恩诺沙星、环丙沙星、替米考星、交沙霉素、强力霉素、土霉素、氯霉素（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；头孢氨苄（Fluka公司）；磺胺甲氧嗪、磺胺氯哒嗪（Sigma公司）；异帕米星（上海士锋生物科技有限公司）。甲醇和乙腈（HPLC级），乙酸铵和甲酸（色谱纯）均购自Dikma公司；EDTA二钠、草酸为分析纯，实验用水为超纯水。1.0 mg/m