基于哮喘小鼠模型的研究生制百部醇提物的作用差异.docVIP

基于哮喘小鼠模型的研究生制百部醇提物的作用差异 　　[摘要] 该文以OVA激发小鼠哮喘为模型，分别口服灌胃给予不同浓度生、制百部醇提取物，测定其脾细胞中Th1及Th2释放的细胞因子，采用RT-PCR技术测定实验小鼠肺组织中GATA-3及T-bet基因表达，比较生、制百部醇提取物治疗小鼠哮喘作用的差异性。结果发现与生品比较，制品给药后更能上调哮喘小鼠脾细胞中炎症因子IFN-γ（P0.05）及下调IL-5（P0.05）；RT-PCR结果发现制品给药后更能上调T-bet/GATA-3（P0.05）表达。该实验表明生、制百部醇提取物均通过调节Th1/Th2比例治疗哮喘，但制品作用更为显著，说明百部炮制前后其药效学上存在显著差异，因此临床治疗哮喘及慢性咳嗽时以制品入药更合理，为进一步揭示百部炮制原理奠定基础。 　　[关键词]生、制百部；哮喘；细胞因子；GATA-3；T-Bet 　　百部为止咳杀虫类药物，《千金方》记载“谓一味取汁浓煎，可愈三十年嗽，有自来矣”。 　　这些记载提示百部尤其擅长治疗久咳不愈。现代医学对于慢性咳嗽机制进行了深入研究，认为慢性咳嗽很大一部分归咎于变异性哮喘（CVA）[1-2]。中医传统著述中没有与CVA完全相对应的病名记载，众医家大多将其分属于“咳嗽”、“风咳”、“肺痹”、“肺痉”、“百日咳”、“咽源性咳嗽”等不同疾病范畴[3]。现代医学研究认为，百日咳属于咳嗽变异性哮喘，百部古代及现代一直是治疗小儿百日咳的要药，查阅古典文献百部治疗咳嗽中主要以制百部入药，现代研究中发现蜜制百部水煎液止咳作用强于生百部[4]，但是目前作者对全国多家医院、药店进行调查，发现很多医生、药师在使用百部或以百部付方时存在生、制不分的现象。本课题组前期实验研究也表明蜜制百部水提液及总生物碱部位止咳作用显著强于生百部，其中总生物碱止咳活性最强[5]，而醇提物中总生物碱溶出率强于其在水煎液中的溶出率，因此本实验选择以生、制百部醇提物作为研究对象，首次采用小鼠哮喘模型来考察其止咳作用差异性及其可能的作用机制，以期为传统中医理论提供现代医学证明，为百部临床使用发挥最佳功效提供一定的指导，为进一步规范百部生熟应用提供支持，为今后进一步深入研究百部总生物碱止咳作用奠定基础。 　　1材料 　　FW100型粉碎机；AS31100A超声波清洗仪（上海亚荣）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣）；超声喷雾加湿器（上海美的）；Rayto RT-6000酶标仪（深圳雷杜）；细胞XZI显微镜（日本Olympus）；BX50生物系统显微镜（日本Olympus）；凝胶电泳仪（美国Fisher Biotech）。 　　刀豆球蛋白A（ConA）、鸡卵白蛋白 （OVA）、RPMI-1640培养液、小牛血清（FBS）、青链霉素、琼脂、溴化乙啶均购于Sigma公司；IL-2，IL-4，IL-5，IL-13，IFN-γ酶联免疫试剂购于RD公司；Trizol购于 Invitrogen公司；RT及PCR试剂盒购于Thermo公司；所有引物均由北京赛百盛科技公司合成；其他化学试剂（天津科密欧）为分析纯。湖北产百部购于安徽药材市场，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为对叶百部。 　　BALB/c小鼠购于大连医科大学动物室，合格证号SCXK（辽）2008-0002。 　　2方法与结果 　　2.1实验药品制备 百部制品制备：按照本实验室前期优化选择的百部蜜制工艺进行炮制。取生百部片100 g加入22.5 g蜜水（12.5 g蜜，10 g水）闷润3 h，置预热的锅内，以140 ℃翻炒6 min，放凉备用。分别取百部生品及制品粉碎过20目筛，以95%乙醇浸泡3 d，过滤继续浸泡3 d，合并滤液，45 ℃旋蒸至浸膏，存储于4 ℃冰箱中，用时以水溶解配置成含生药2.0，1.0，0.5 g?mL-1的混悬液口服给药。致敏液配制：称取OVA 20 mg，加入生理盐水1 mL中，充分溶解后，取出0.4 mL加入生理盐水9.6 mL中，混匀，取该液与等体积的佐剂液态铝混合，40 ℃放置30 min后使用。 　　2.2动物分组 80只BABL/c小鼠共分为8组，每组10只，分别为PBS空白对照组，OVA空白对照组，生百部醇提物高、中、低剂量组，蜜制百部醇提物高、中、低剂量组。 　　2.3哮喘模型建立及给药 采用系统致敏加局部激发的方法制作哮喘模型[6]，见图1。 　　2.4脾细胞制备 小鼠处死，无菌条件下取其脾脏，细胞滤网滤过，于表面皿加入红细胞裂解液为细胞滤液的3～5倍，装入EP管中，室温震荡5 min，4 ℃离心机1 200×g离心10 min，弃去上清，以培养液洗沉淀后1 200×g 离心10 min。最后向沉淀加入RPIM 1640培养液。 　　2.5ELISA试剂盒测定 将脾细