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康氏木霉固体发酵产孢子粉工艺的研究 　　摘要 通过单因素发酵试验和正交试验，以麸皮、米糠、稻草粉、蔗渣等农副产品为固体培养基，进行了木霉固体发酵工艺优化。结果表明：最佳条件组合为麸皮50 g，葡萄糖1.0%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾0.05%，发酵温度28 ℃，初始pH值7.0，料水比1∶1.2，发酵周期7 d，经80 cm×40 cm×5 cm不锈钢浅盘固体发酵扩大培养，孢子数产量可达9.6×109 cfu/g，为康氏木霉菌生防制剂生产应用提供了参考。 　　关键词 康氏木霉；固体发酵；孢子 　　中图分类号 Q939.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）08-0194-03 　　木霉菌是目前使用最广泛的生防有益菌[1]，对多种土传病原菌具有抑制作用，对白绢病、立枯病、瓜果霉病、疫病等有很好的防治效果[2]。它具有广谱的生防效果和广泛适应性，还可以作为有机菌肥增加作物产量。木霉的生防机制主要包括竞争、重寄生、促进植物发芽、生长、开花的作用等[3]。目前提倡以农业可持续发展为宗旨的植物病虫害生物防治，木霉对人畜无毒害、不污染环境，在绿色农业生产中起着越来越重要的作用[4]。目前生产的木霉菌剂多为分生孢子制剂，与液体发酵相比固态发酵产生的孢子具有较高的质量，孢子对干燥和紫外照射的抵抗性更强，孢子的存活率更高、贮存期加长，并且发酵产品干燥后无须提纯分生孢子可直接制备成菌剂。固体发酵操作简单、材料来源丰富，大量农作物废弃物可作为优良的固体培养基，具有生产成本低廉，孢子产量高、易于保存及运输等优点[5]。该研究通过单因素的正交试验，确定固体发酵工艺条件，为木霉制剂作为生防产品的大规模工业生产提供理论依据和技术参数。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 供试菌。康氏木霉，由湖南农业大学生命科学院生物工程实验室提供。 　　1.1.2 主要仪器。立式高压蒸汽灭菌锅、控温培养箱、光学显微镜、打孔不锈钢浅盘等。 　　1.1.3 培养基。大试管固体培养基：麸皮（过60目筛）5.0 g，琼脂2.0 g，自来水100 mL，121 ℃灭菌25 min。 　　1.1.4 康氏木霉孢子液的制备。利用大试管琼脂斜面培养木霉菌，待菌丝长满试管斜面并变为绿色后，向每个试管中加入50 mL无菌水，用玻璃棒搅拌使孢子悬浮在水中，用移液管吸出悬浮液移入灭菌三角瓶中，然后用灭菌水将孢子浓度调整为1×106 cfu/mL备用。 　　1.2 试验设计 　　1.2.1 500 mL塑料瓶固体发酵试验。先以麸皮、米糠、稻草粉、玉米秸秆粉、锯木屑、蔗渣（均过80目筛）作为固态发酵的初始培养基，筛选出最佳初始固体培养基。再以其为原料，按原料∶水=1∶1.2的比例混匀，并向500 mL的塑料瓶中加入50 g混匀的固体培养基作为基础培养基，加入不同种类和浓度的碳源、氮源、无机盐；并在不同单因素条件[6]（温度、pH值、料水比、装料量、接种量）下，每个水平3个重复，用纱布和牛皮纸包好，121 ℃灭菌30 min，冷却后接种，置于28 ℃恒温培养箱培养7 d后取样检测孢子数量，根据孢子数量高低确定最佳培养基和发酵条件。 　　1.2.2 80 cm×40 cm×5 cm不锈钢浅盘固体发酵试验。在500 mL塑料瓶固体发酵正交试验基础上，用80 cm×40 cm×5 cm打孔不锈钢浅盘进行发酵放大培养。 　　1.3 生物量的测定 　　孢子计数方法：称取10 g固体培养物，用无菌水定量稀释，充分振荡混匀后，用血球计数板计数。 　　1.4 数据处理 　　采用Microsoft—Excel、SAS软件进行数据处理和方差分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 单因素固体发酵优化试验 　　2.1.1 初始固体培养基产孢量的影响。向500 mL塑料瓶加入50 g不同固体基础培养基，用纱布和牛皮纸包好，121 ℃灭菌30 min，灭菌冷却后接入1×106 cfu/mL的孢子液3 mL，然后置于28 ℃恒温培养箱培养7 d后取样检测孢子数量。从图1可以看出，以麸皮为固体基础培养基孢子产量最高，达到2.5×109 cfu/g，其次是米糠和锯木屑，分别是1.8×109 cfu/g和1.5×109 cfu/g，所以选择麸皮作为固体基础培养基。 　　2.1.2 外加碳源对菌产孢量的影响。从图2可以看出，添加葡萄糖芽孢数达4.8×109 cfu/g，与其他碳源差异显著，说明葡萄糖作为快速利用碳源有利于康氏木霉迅速繁殖，也有利于产生孢子[7]。 　　2.1.3 外加氮源对产孢量的影响。从图3可以看出，菌株孢子数以无机氮源硫酸铵最占优势，有机氮源蛋白胨次之，分别达10.9×109、9.8×109 cfu/g。说明该菌既能利用有机氮源