超分辨定位成像中的弱光探测方法研究-生物医学工程专业论文.docx

万方数据 万方数据 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本论文属于 保密□， 在 年解密后适用本授权书。 不保密□。 （请在以上方框内打“√”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘 要 超分辨定位成像（Super-resolution localization microscopy，或简称定位成像）技 术实现了纳米量级的空间分辨率，成为生命科学领域极具潜力的研究工具之一。定 位成像本质上是依赖单分子成像实现的，然而单分子的荧光信号通常在几百至几千 个光子，并且要覆盖多个像素，所以单分子微弱信号的探测是实现定位成像的关键 技术之一。传统的定位成像通常使用读出速度较慢（10 MHz）的弱光探测器--电子 倍增电荷耦合器件（Electron multiplying charge coupled device, EMCCD），成像通量 较小，限制了该技术在大样本超分辨成像（如亚突触水平神经回路成像）等方面的 应用。因此研究适用于定位成像的新型弱光探测方法对提高成像通量是必要的。本 文围绕该问题，建立了一套研究弱光探测器的超分辨定位成像能力的方法。具体内 容如下： （1）通过表征探测器噪声和光子传递曲线等特性，从弱光探测灵敏度和成像信 噪比等方面定量研究不同类型弱光探测器的整体成像性能。结果表明：(i) 在弱光探 测灵敏度方面，以 Andor iXon 897 为代表的 EMCCD 相机在电子倍增工作模式下具 有最高灵敏度（最小可探测器限为 2 photon），以 Hamamatsu Flash 4.0 为代表的 sCMOS 相机的灵敏度稍差（最小可探测限为 3 photon）；(ii)在成像信噪比方面， EMCCD 相机在极微弱信号强度下（13 photon/pixel）成像信噪比最高，但是随着信 号强度的增加，sCMOS 相机的成像信噪比优于 EMCCD 相机；(iii)sCMOS 相机具备 并行高速数据读出能力，其读出速度（以 Hamamatsu Flash 4.0 为例，400 MHz）比 EMCCD 相机（iXon 897 为 10 MHz）快四十倍，但是 sCMOS 相机的成像均匀性较 差。综合以上发现，sCMOS 有望为提高定位成像的成像速度和通量提供新的有效途 径。 （2）基于点状发光体的重复成像与定位，发展了一种通过定量表征探测器的单 分子探测和定位能力的实验方法。结果表明，该方法对定位精度的测量达到了~1 nm 的精度。进一步利用该方法，我们首次演示了在超分辨定位成像的典型信号范围 （50-2000 photon/pixel）内，商品化 sCMOS 相机（Hamamatsu Flash 4.0）可以表现 I II万方数据 II 万方数据 出优于 EMCCD（Andor iXon 897）的成像性能。此发现证实 sCMOS 相机有能力代 替常用的 EMCCD 相机，将定位成像的成像通量提高~40 倍，为亚突触水平神经回路 成像提供了新的探测途径。 （3）基于仿真方法，利用单分子成像模型及固定图形噪声模型，系统研究了 sCMOS 相机的成像不均匀性对单分子定位的影响。结果发现：(i)固定图形噪声几乎 对定位精度没有影响，但是会引入一定的定位偏差；(ii)当额外增加像素固定图形噪 声一半强度的列固定图形噪声时定位偏差相应的只增加了~20%。对 Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS 相机而言，其像素固定图形噪声要高于列固定图形噪声~3-5 倍。因此， 该 sCMOS 相机的列固定图形噪声对单分子定位的影响很难察觉。该结论消除了研究 人员对 sCMOS 相机的成像不均匀性的顾虑，有利于推动 sCMOS 相机在定位成像领 域中的应用。 关键词：超分辨定位成像, 弱光探测器, sCMOS 相机, EMCCD 相机，成像性能 PAGE VI万方数据 PAGE VI 万方数据 Abstract Super-