茶树酯型儿茶素合成途径及酚类物质积累特异性研究-茶学专业论文.docx

安徽农业大学博士学位论文摘要 安徽农业大学博士学位论文 摘要 i i 摘要 儿茶素是茶树的主要次生代谢产物，对决定茶叶品质及其健康功效具有重要作 用。本文重点探索了茶树酯型儿茶素的合成代谢途径，研究了茶树酚类物质合成积累 的组织特异性和发育特异性。主要研究结果如下： 1.建立了茶树次生代谢研究的重要平台茶树愈伤组织培养体系。 开展了愈伤组织诱导、筛选、保存等方面研究，在此基础上，建立了茶树愈伤组 织培养体系，为开展茶树儿茶素合成代谢及调控研究建立了良好平台。 研究结果表明，在H、S和B三种诱导培养基中，只有B培养基适合于诱导生长迅 速、组织疏松、质地均一的愈伤组织。从外植体上看，种子诱导出的愈伤组织具有较 强的植株再生能力；幼茎和叶片诱导出的愈伤组织，其生长速度快、组织疏松，但再 生能力弱。 采用目视法和二分法，结合TLC和HPLC分析，对愈伤组织进行了筛选，得到含 不同儿茶素含量的细胞系 “yunjing63Y” 和 “yunjing63X” 。分析结果显示，细胞系 “yunjing63Y”和“yunjing63X”的儿茶素组分虽与鲜叶相似，但儿茶素含量差异较大， 前者为7.77 mg g-1DW，后者仅为0.13 mg g-1DW。 为保存具有稳定代谢能力的优良茶细胞系，本文对茶愈伤组织玻璃化法超低温保 存技术进行了研究。结果表明：采用预培养4d、60% PVS2冰浴装载20 min、100% PVS2 冰浴脱水处理60 min、40℃复温解冻细胞，可使茶愈伤组织的细胞存活率达到76%。 2.探索了酯型儿茶素的合成代谢途径及其关键酶。 采用体外酶学手段，结合TLC、HPLC、LC-MS、1H NMR 和 13C NMR、蛋白质 分离纯化技术，研究了酯型儿茶素合成和水解途径，建立了酯型儿茶素合成代谢相关 酶的检测体系，分离纯化、鉴定了酯型儿茶素合成底物1-O-没食子酰-β-葡糖苷，纯化 了酯型儿茶素合成酶：表儿茶素没食子酰基转移酶。 研究结果首次提出了茶树酯型儿茶素合成及代谢途径，即茶树酯型儿茶素合成途 径包含两步反应，首先没食子酸在依赖 UDPG 的没食子酰葡萄糖基转移酶 (UDP-glucose:galloyl-1-O-β-D-glucosyltransferase，UGGT)作用下，形成1-O-没食子酰-β- D-葡糖苷(βG)。1-O-没食子酰-β- D-葡糖苷(βG)作为活化的没食子供体，在表儿茶素没食 ii ii 子酰基转移酶(epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose O-galloyltransferase，ECGT)作用下， 将没食子基团转移到非酯型表儿茶素的C环-3-位点上，形成酯型儿茶素。此外茶树中酯 型儿茶素，在酯型儿茶素水解酶(galloylated catechins hydrolase, GCH)催化下，可被水解 形成非酯型儿茶素和没食子酸。 为进一步寻找ECGT 和 UGGT在茶树中存在的证据，本文从茶树中分离、纯化并 鉴定了βG；建立了基于粗酶提取液的UGGT、ECGT和GCH酶最适检测体系；利用硫 酸铵分级沉淀、疏水柱层析、亲和柱层析和蛋白质的SDS电泳分析技术，对 ECGT进行了纯化；纯化后的ECGT其活性提高了1420倍。 3.研究了茶树中酚类物质合成与积累的器官组织及发育特异性。 利用LC-TOF/MS、分光光度计法等技术研究了主要酚类物质在茶树不同器官、 叶片不同发育时期的积累规律。利用q-RTPCR技术和酶学分析手段，研究了茶树酚类 物质主要合成酶和基因在不同器官、叶片不同发育时期的表达规律。利用香草醛盐酸 显色技术，研究了儿茶素在茶树体内定位的器官组织特异性。 研究结果显示，不同器官中酚类物质组分及含量差异较大。在鲜叶和茎中的儿茶 素、黄酮醇、酚酸组分较多且含量较高；而在根中则相反，只能少量检测到 B 环双 羟基的儿茶素和黄酮醇，缺乏酯型儿茶素。茶树中原花青素主要以儿茶素的二聚和三 聚体形式存在，从含量差异上看，根中原花青素含量明显高于鲜叶和茎；从组分差异 上看，根中主要是 B 环双羟基类型，而叶中则是 B 环一羟基、双羟基和三羟基类型 同时存在。从基因表达差异上看，从鲜叶到茎到根，CHI、F3H 和 F3’5’H 表达依次 降低，这些差异可能与根中儿茶素和黄酮醇含量低、缺乏 B 环三羟基化合物有关。 酶学实验显示，从鲜叶到茎到根，GCH 酶活逐渐降低，UGGT 和 EGCT 酶活在鲜叶 和茎中无明显差异，而在根中则检测不到活性，这可能是根中缺乏酯型儿茶素的原因 之一。 研究结果还显示，随着鲜叶的发育，儿茶素、黄酮醇、酚酸、花青素和原花青素 表现出不同的变化规律。其中儿茶素含量在一叶中最高，其次是芽；随着鲜叶发育程 度增加，儿茶素单体GC