茶氨酸合成相关基因RNAi载体的构建及茶树遗传转化分析-茶学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE III tumefaciens. After a pre-culture of 3 days, the acceptor leaves of tea cv. Longjing-43 was infected for 15 min by activated Agrobacterium strain EHA105 with plant RNAi expression vector pCAM-RNAi-GS, and then co-cultured in the YMB medium for 4 days. After the residual bacterium were removed from the infected leaves on screening medium with kanamycin, 8 kanamycin-resistant calli were obtained. Out of the eight calli, three calli were proved to be positive and the remaining five calli negative by GUS histochemistry staining and PCR analysis. Theanine content of callus-4 and callus-5 showed a reduction of 85.09% as compared to the controls using HPLC method with trifluoroacetic acid (TFA) elution. Key words：Theanine synthesis related gene GS1-1, Zero Background T-Vector System, RNAi, Genetic transformation, kanamycin-resistant callus 目录 摘要 I Abstract II Key words III 术语与缩略语表 VII 1 文献综述1 HYPERLINK \l _TOC_250000 1.1 RNA 干扰技术 1 1.1.1 RNAi 的发现 1 1.1.2 RNAi 的作用机制和原理 1 1.1.3 RNAi 技术在植物生物学中的应用 2 1.1.4 RNAi 载体构建的方法 4 1.2 茶氨酸研究进展6 1.2.1 茶氨酸概述6 1.2.2 茶氨酸的生物合成研究进展6 1.2.3 合成茶氨酸相关酶研究进展6 1.3 茶树遗传转化研究进展8 1.3.1 影响茶树遗传转化的因素8 1.3.2 茶树遗传转化方法8 2 引言10 2.1 研究目的及意义10 2.2 研究内容和技术路线10 2.2.1 研究内容10 2.2.2 技术路线 11 3 材料与方法12 3.1 试验材料12 3.2 仪器与试剂12 3.2.1 主要实验仪器12 3.2.2 主要试剂12 3.2.3 引物合成与测序13 3.3 试验方法13 3.3.1 茶氨酸合成相关基因（GS1-1）3’-端序列获得 13 3.3.2 RNAi 载体的构建 16 3.3.3 茶树叶片遗传转化研究22 4 结果与分析25 4.1 茶氨酸合成相关基因的 3′-端序列获得 25 4.1.1 总 RNA 提取与质量检测 25 4.1.2 茶氨酸合成相关基因的 3′-端序列获得 25 4.2 RNAi 载体的构建 26 4.2.1 目的片段和填充片段扩增与验证26 4.2.2 ―发夹‖结构扩增与验证 27 4.2.3 RNAi 载体的构建与验证 29 4.3 ―龙井 43‖叶片的遗传转化 30 4.3.1 诱导叶片愈伤最佳激素配方的确定30 4.3.2 卡那霉素筛选浓度的确定31 4.3.3 农杆菌介导遗传转化结果32 5 讨论36 5.1 茶氨酸合成相关基因 GS1-1 的 RNAi 载体构建 36 5.2 农杆菌介导茶树叶片遗传转化抗性愈伤的获得36 5.3 RNAi 在茶学研究的应用…………...……………………………………...36 6 结论38 参考文献40 附录46 致 谢46 作者简介49 在学期间发表的论著及科研成果49 图表清单 表 3-1 试验所有引物信息 表 4-1 不同激素配比对叶片诱导愈伤的影响 表 4-2 茶树叶片组织对 Kan 的基础抗性测定 图 1-1 RNAi 作用机制 图 1-2 Gateway 原理图 图 1-3“零背景克隆”技术构建 RNAi 表达载体 图 1-4 茶氨酸化学结构 图 2-1 试验技术路线 图 3-1 两