草鱼单核巨噬细胞的分离鉴定和激活新机制的研究-生物医学工程专业论文.docxVIP

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草鱼单核巨噬细胞的分离鉴定和激活新机制的研究-生物医学工程专业论文

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方 外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为 获得电子科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 作者签名: 日期: 年 月 日 论文使用授权 本学位论文作者完全了解电子科技大学有关保留、使用学位论文 的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘, 允许论文被查阅和借阅。本人授权电子科技大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 作者签名: 导师签名: 日期: 年 月 日 摘要 摘要 I I 摘 要 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属于低等脊椎动物,是我国重要的经济 淡水鱼类之一,对于其免疫系统工作机理的认识有助于科学地指导生产实践 并拓宽对于免疫系统进化方式的认识。由于处于复杂的水生环境中,鱼类的 先天性免疫系统在抵御病毒、细菌、原生动物等的入侵中发挥非常重要的作 用。巨噬细胞是先天性免疫系统中的重要成员,由于具有自增殖特性和在不 同微环境中的极化特性,因而具有作用持久和方式多样化的特性,在先天性 免疫系统中处于核心地位。头肾扮演着类似于哺乳动物骨髓的角色,是鱼类 髓系细胞的生发地。本文针对草鱼头肾单核/巨噬细胞的分离、鉴定和激活等 方面,开展了相关因子的克隆鉴定和重组表达工作,探索了头肾单核/巨噬细 胞以及淋巴细胞的分离方法,并多方面鉴定所分离的细胞,最后阐明了一个 激活的淋巴细胞参与的单核/巨噬细胞的激活新机制。研究结果主要包括以下 方面: 1. 克隆获得两个能促进巨噬细胞增殖和分化的草鱼巨噬细胞集落刺激因 子(M-CSF)的 cDNA 序列,分别命名为 gcM-CSF1 和 gcM-CSF2。经进化分 析表明,这两条序列分别与已知的斑马鱼和虹鳟的 M-CSF1 和 M-CSF2 聚为一 类,而 M-CSF2 与哺乳动物的 M-CSF 的进化关系相对较远。同源分析表明, 虽然序列的一级序列相似度较低,但 gcM-CSF1 和 gcM-CSF2 都含有较为相似 的结构特征,包括信号肽、保守的 CSF-1 结构域、跨膜区和胞内区,且 gcM-CSF1 还具有一段位于 CSF-1 结构域之后的较长的胞外区序列。同时,分 离鉴定了草鱼 M-CSF 受体(M-CSFR),从进化和同源分析以及组织分布性上 确认所获得的序列为目的序列,为之后作为分子标记鉴定单核/巨噬细胞打下 了基础。 2. 探索了鱼类 M-CSF 重组表达的新方法。以往的研究中均采用动物细胞 重组表达 M-CSF,或者难以获得纯的 M-CSF 蛋白,或者得率较低而不适合大 量制备。本研究尝试了原核表达系统之后,最终优化酵母表达系统的培养方 案,并高效地获得了糖基化的草鱼 M-CSF 重组蛋白,尤其是获得了 M-CSF2 的重组蛋白,这项工作在鱼类的研究中尚未见报道。用酵母表达获得的两种 M-CSF 重组蛋白可用于甄别鱼类的两个 M-CSF 的功能和诱导巨噬细胞系的产 生。 3. 借助双层不连续密度梯度离心分离的方法,富集了草鱼单核/巨噬细胞 II II 和淋巴细胞,然后多方面对细胞作出鉴定:⑴ 借助细胞染色从形态上鉴定, 发现超过 90%的细胞大小在 10-12 ?m,含偏离中心的细胞核,核质比较小, 符合金鱼单核/巨噬细胞的特征;而来自于两层分离液中间的细胞群中 80%的 细胞为约 6-8 ?m 的小圆形细胞并含有相对较大的细胞核。⑵ 分子标记检测 结果显示,在新鲜分离的头肾细胞( HKC )中能检测到单核 / 巨噬细胞 (M-CSFR)、T 细胞(TCR?)、B 细胞(IgM)以及中性粒细胞(MPX/MPO) 的标记分子的表达。M-CSFR 的表达几乎限于获取的上层细胞,而 TCR?和 IgM 的表达则主要存在于获取的下层细胞。此外,MPX/MPO 的表达在两层细 胞中都较低,说明在分离的细胞中的中性粒细胞的污染较少。根据以上形态特 点和标记基因表达谱分析可知,获取的上层和下层细胞分别被命名为单核/巨 噬细胞和淋巴细胞。 ⑶ 重组草鱼 IFN-?(rgcIFN-?)单独或联合 LPS 作用 72 h,可刺激单核/巨噬细胞释放 NO 水平升高,但淋巴细胞对此无反应,这 与哺乳动物中单核/巨噬细胞与淋巴细胞对 IFN-?的反应动力学一致。⑷ 草鱼 单核/巨噬细胞也具有高细胞密度下的自增殖能力,低密度细胞培养可在重组 草鱼 M-CSF(rgcM-CSF)的作用下获得增殖能力

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