草鱼白细胞介素10的免疫调节功能及其作用机制研究-生物医学工程专业论文.docxVIP

摘 摘 要 I I 摘 要 在哺乳动物免疫系统中，白细胞介素 10（Interleukin-10，IL-10）被认为是具 有多重功能的重要细胞因子。IL-10 由多种细胞分泌并作用于各种免疫细胞，如 T 细胞、B 细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞，调控这些细胞的生长、成熟、增殖、 分化与活化，进而影响机体的天然免疫和获得性免疫，并与其它细胞因子一起维 持了免疫系统的稳定。 硬骨鱼 IL-10 在多种鱼类包括斑马鱼、金鱼、鲤鱼和虹鳟中被克隆鉴定，但 有关硬骨鱼 IL-10 的免疫调节功能知之甚少，其受体和细胞信号传导途径，以及 作用机制均有待阐明。本论文研究草鱼 IL-10 的免疫学功能，不仅揭示其保守的 抑炎症功能，而且阐明它和另一经典抑炎症细胞因子 TGF-β1 参与免疫反应调节 的相互关系和作用机制，从而拓展了对鱼类 IL-10 免疫学地位的认识。另外，为 了解草鱼 IL-10 发挥作用的分子机制，进一步鉴定了草鱼 IL-10 介导的 IL-10 受体 1（IL-10R1）和 IL-10 受体 2（IL-10R2）及其下游信号通路（STAT3）和靶基因 细胞因子信号转导负调控蛋白 3（Suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）。为 获悉草鱼 IL-10 的产生机制，初步探讨了 LPS 和 IFN-γ 对草鱼 IL-10 的转录调控 机制。具体研究内容如下： 1. 重组草鱼 IL-10 蛋白的活性鉴定和参与的免疫刺激作用：（1）通过硬骨鱼 同源序列比对克隆获得草鱼 IL-10 cDNA 全长序列，并用生物信息学方法分析其 结构域与保守特性。（2）实时荧光定量 PCR（qPCR）方法检测草鱼 IL-10 在各组 织中的表达，结果表明草鱼 IL-10 主要在免疫相关组织头肾、肾、鳃中有较高表 达，提示草鱼 IL-10 可能参与免疫相关反应。（3）构建原核表达系统并采用亲和 纯化法获得高纯度重组草鱼 IL-10 蛋白，利用此蛋白研究草鱼 IL-10 免疫学功能。 （4）细胞活性检测结果表明草鱼 IL-10 能够促进外周血淋巴细胞 PBLs 的细胞活 性。相似地，转化生长因子 β1（Transforming growth factor β1，TGF-β1）也能促 进 PBLs 的细胞活性。（5）为揭示上述作用的机制，采用草鱼 IL-10 免疫中和实验 发现草鱼 TGF-β1 是依赖于 IL-10 发挥上调 PBLs 细胞活性的作用。（6）上述结论 得到进一步支持，即 qPCR 和竞争抑制酶联免疫吸附（CI-ELISA）实验表明草鱼 TGF-β1 促进 IL-10 的 mRNA 表达和蛋白分泌水平，从而证明 TGF-β1 可能通过诱 导 IL-10 的产生来上调 PBLs 的细胞活性。本章证明了重组草鱼 IL-10 的免疫刺激 作用，特别是揭示了鱼类 TGF-β1 和 IL-10 在发挥免疫刺激作用中的上下游关系。 2. 草鱼 IL-10 和 TGF-β1 在炎症反应调节中的作用和相互关系：（1）在草鱼 II II 头肾单核/巨噬细胞中，加入的草鱼 IL-10 和 TGF-β1 均抑制 LPS 刺激促炎症信号 因子 TNF-α、IL-1β、iNOS 和 IL-8 的表达。（2）相反地，草鱼 IL-10 和 TGF-β1 的抗体均放大 LPS 对上述促炎症信号因子 mRNA 的上调作用，提示内源的 IL-10 与 TGF-β1 发挥了抑制促炎症因子表达的作用。（3）机制研究发现，草鱼 IL-10 与 TGF-β1 均能促进草鱼 IκBα 全蛋白的表达, 即抑制 IκBα 的降解从而抑制 NF-κB 通路的激活，表明草鱼 TGF-β1 和 IL-10 可能通过抑制 NF-κB 信号通路控制 LPS 诱导的促炎症因子表达。（4）草鱼 IL-10 抗体和 TGF-β1 抗体分别对 TGF-β1 和 IL-10 的调节作用不产生影响，提示在 LPS 激活的头肾单核/巨噬细胞中，TGF-β1 与 IL-10 独立发挥抑制功能。这些结果验证了鱼类 IL-10 的抑炎症作用及其机制，以 及与另一抑炎症因子 TGF-β1 平行发挥作用的关系，从而丰富了鱼类炎症反应控 制机制的知识。 3. 草鱼 IL-10 受体及信号通路的鉴定：(1) 采用同源克隆技术获得了草鱼 IL-10 受体 1（IL-10R1）、细胞因子受体家族成员 4（cytokine receptor family member 4，CRFB4）以及细胞因子受体家族成员 5（CRFB5），并进行了生物信息学分析。 （2）qPCR 检测结果表明草鱼 IL-10R1 表达于鳃、胸腺、脾、头肾等免疫相关组 织，而草鱼 CRFB4 与 CRFB5 则广泛表