草鱼细菌性败血病的病原、病因及灭活疫苗研制-海洋生物学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 摘 要 草鱼(Ctenopharyngod idellus)是我国重要的淡水养殖经济鱼类，也是潮州市 的重要水产养殖品种。近几年来，每年 8 到 11 月份，潮州市江东镇养殖区的草 鱼细菌性败血病病害严重，经济损失较大。为了找到该病的预防和控制方法，本 课题组从病原、病因、疫苗研制及其效果评价等方面对草鱼细菌性败血病进行了 较系统的研究，主要结果如下： 一、江东养殖区细菌性败血病爆发的主要原因 本研究主要从养殖池塘的水质环境和饲养管理等方面探讨细菌性败血病爆 发的主要原因。2010 年 8 月到 2011 年 3 月的八个月期间，在江东养殖区分别选 取有发病史和没发病史的对照池塘各 3 个，对其发病情况和水质每月进行 1-2 次 监测，检测的水质指标有水温、溶解氧、pH、氨氮、亚硝态氮和无机磷。结果 发现：有发病史的池塘 8-11 月出现了细菌性败血病，无发病史的池塘未发现该 疾病；该病的爆发呈现出较明显的季节性变化，在水温较高的 8 到 9 月发病严重， 一直持续到 11 月份，在水温较低的 12 月到次年 3 月份期间较少发生。与未发病 池塘相比，发病池塘在 8 月和 9 月份的氨氮含量显著升高(P0.05)，其中 9 月份 的含量高达 1.06 mg/L；水体溶解氧在 8 个月的监测期内均低于未发病池塘；发 病池塘的水体 pH 除 9 月份高于未发病池塘外，其余月份均低于未发病池塘。发 病池塘的亚硝氮含量在 10 月和 11 月发病期间处于峰值，其无机磷含量在 8－9 月低于未发病池塘；发病池塘的蓝藻含量在发病期间较高，微囊藻含量最高。发 病池塘的养殖密度较未发病池塘要大，投喂饲料较多。结果说明：养殖池塘的水 质恶化与饲养管理欠科学可能是细菌性败血病爆发的重要原因。 二、细菌性败血病病原的分离鉴定 从患病草鱼体内分离得到一株优势细菌，在 LB 培养基和 TCBS 培养基上的 颜色分别为白色和黄色；菌落表面光滑、圆润，为革兰氏阴性菌。细菌的生理生 化反应结果与嗜水气单胞菌相同。以该细菌的基因组 DNA 为模板，以细菌 16S rRNA 的通用引物 P27F 和 P1492R 进行 PCR 扩增，得到的序列长度为 1445bp； 将 16S rRNA 序列进行同源比对和系统发育树分析，发现该菌与嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)聚为一个分支，同源性高达 99%。抑菌试验结果显示：该 菌对 8 种抗生素的敏感性从强到弱的顺序为：阿莫西林、氟苯尼考、诺氟沙星和 I II II 甲砜霉素、链霉素、恩诺沙星、磺胺甲恶唑、青霉素钠。即该菌对阿莫西林和氟 苯尼考最敏感，对磺胺甲恶唑、青霉素钠不敏感。 三、灭活疫苗研制及免疫效果评价 将从患病草鱼体内分离得到的嗜水气单胞菌菌株活化后进行扩大培养，采用 福尔马林溶液灭活处理后制成疫苗；然后以该灭活疫苗采用胸鳍基部注射方式对 平均体重 50±5 克的 60 尾草鱼幼鱼进行免疫接种，实验组每尾注射浓度为 1.0×108cfu/mL 的灭活疫苗 0.3ml，对照组注射等量 0.85%的无菌生理盐水。分别 于第 0，7，14，21，28 天抽血取样测定免疫指标变化，并在第 28 天每尾注射 0.3mL 浓度为 1.0×108cfu/mL 的嗜水气单胞菌菌液进行攻毒，然后观测记录实验 组和对照组鱼的死亡率，以评估免疫保护效果。结果显示：在接种后的 0-28 天 内，实验组和对照组鱼血清中各项免疫指标的变化范围分别为：溶菌酶活力是 36.3-82.5U/mL 和 36.3-37.1U/mL ， 超 氧 化 物 歧 化 酶 是 9.91-20.48 U/mL 和 9.91-14.02 U/mL，酸性磷酸酶是 45.1-85.3U/100mL 和 45.1-51.1 U/100mL，碱性 磷酸酶是 19.0-54.0U/100mL 和 19.0-24.8U/100mL，抗体凝集效价是 1:4-1:512 和 1:4-1:8。攻毒后的 12 天内，实验组的累积死亡率为 26.67%，对照组为 93.33%， 免疫保护力为 71.43%。结果表明：注射嗜水气单胞菌灭活疫苗可明显提高草鱼 的免疫力，可有效减少由该细菌引起的死亡率。因此，通过注射灭活疫苗来预防 草鱼细菌性败血病是可行的。 以上结果表明：江东养殖区池塘的水质恶化及饲养管理欠科学是草鱼细菌性 败血病爆发的重要原因；嗜水气单胞菌为其主要病原。通过灭活疫苗免疫接种能 够提高草鱼的免疫力，降低死亡率。这些研究结果可为草鱼细菌性败血病的防治 提供理论基础，对当地养殖业的健康发展具有重要的实际意义。 关键词：草鱼；细菌性败血病；嗜水气单胞菌；酶活力 Abs Abstract PAGE PAGE IV Abstr