藏羚羊血红素氧合酶 1基因编码区的克隆及序列分析-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

青海大学医学院 青海大学医学院 2009 级高校教师在职攻读硕士学位研究生毕业论文 第 第 PAGE 10 页 共 43 页 中文摘要 藏羚羊血红素氧合酶-1 基因编码区的克隆及序列分析 藏羚羊（Pantholops hodgsonii）俗称长角羊，偶蹄目、牛科、藏羚属，是青藏 高原特有的国家一级保护动物，主要分布在青藏高原以及新疆南部、四川西北隅 和甘南的部分地区。常年生活在海拔 3500m～5500m 高寒草甸、高寒草原和高寒 荒漠等低氧环境，尤以 4500m～5500m 的无人区较常见，具有极强的抗缺氧、耐 高寒等适应能力，是研究高原低氧高寒等适应机制最理想的动物模型之一。 血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）即热休克蛋白 32 ( heat shock protein,HSP32) ,又称诱导型 HO-1,是一种拮抗氧化应激的抗氧化酶 ,分子量为 32 kD,广泛分布于全身组织,尤其是单核细胞、巨噬细胞系统的微粒体中多有分布 , 以肝脏、肾、心、肺、脾脏、骨髓和网状内皮细胞中活性最高。人 HO-1 大约有 288 个氨基酸，HO-1 基因定位于人染色体 22q12 , HO-1 基因含有 4 个内含子 , 5 个外显子。HO-1 能被多种氧化应激的损伤因素所诱导 ,如热休克、高寒、血红素、 过氧化氢、高氧、内毒素、低氧、多种细胞因子、重金属离子和一氧化氮 (NO)、 紫外线辐射等 ,这些诱导因素的共同特征是导致氧化应激发生。HO-1 是近些年倍 受重视的细胞内源性抗氧化酶, 本质上属于应激蛋白, 能在各种氧化应激状态下 出现适应性表达, 发挥抗自由基等多种细胞保护作用。HO-1 抗氧化作用源于其对 促氧化的游离血红素的降解和催化生成具有强大抗氧化能力的产物胆红素, 胆红 素具有非特异性清除多种自由基的效应。藏羚羊能在高海拔低氧高寒地区生存， 奔跑时速可以高达 60Km/hr，且可以连续奔跑 70-100Km，说明其从基因分子水平 有高度的保护和适应机制,而血红素氧合酶-1（HO-1）具有广泛的细胞保护和抗氧 化效应。为了揭示藏羚羊血红素氧合酶-1（HO-1）在细胞保护和抗氧化方面的作 用及对低氧高寒适应的生物学机制，我们从藏羚羊肝脏组织克隆了血红素氧合酶 -1 基因并测序，并对其序列作了分析。 从藏羚羊肝脏组织中提取总 RNA,用 RT-PCR 的方法对藏羚羊 HO-1 基因部分序 列进行克隆和分析，结果得到藏羚羊 HO-1 基因部分序列 1353bp，开放阅读框（open reading frame, ORF）藏羚羊 HO-1 基因编码区长度为 897bp,编码 298 个氨基酸 （GenBank 登录号为：JQ809687）；序列分析表明，藏羚羊 HO-1 基因的编码区序 列与脊椎动物山羊和牛的相似性分别达到 98%和 96%，氨基酸序列相似性分别达 到 92%和 97%，与其他脊椎动物 HO-1 基因的核苷酸及氨基酸序列相似性达到 86% 和 87%以上，显示出高度保守性。在系统进化方面 , 藏羚羊与山羊的血红素氧合 酶-1 起源相同,亲缘关系最近。与山羊血红素氧合酶-1 编码区的序列相比较,发现 藏羚羊血红素氧合酶-1 基因中第 123 位密码子突变为( GCC→ACT),第 230 位密 码子突变为(TGG→TGG),第 284 位密码子突变为(GCC→GGC),第 287 位密码子 突变为(AAT→CAT),推导的氨基酸的序列也发生突变,即第 123 位的丙氨酸(Ala) 突变为苏氨酸 (Thr), 第 230 位的丝氨酸(Ser)突变为亮氨酸 (Leu),第 284 位的亮 氨酸 (Leu) 突变为苯丙氨酸 (Phe), 第 287 位的蛋氨酸 (Met)突变为半胱氨酸 (Cys)。系统进化树分析表明 , 藏羚羊血红素氧合酶-1 与其他动物的血红素氧合 酶-1 集成一束,它们与高等动物的血红素氧合酶-1 源于共同的祖先,但分别处于不 同的进化分支上；而藏羚羊血红素氧合酶-1 与山羊的血红素氧合酶-1 源于同一支 , 亲缘关系最近,其次是牛。关于基因变异位点与抗氧化应激及高原低氧高寒适应的 关系尚有待于进一步研究。至此，本研究为进一步阐明藏羚羊在高原低氧高寒适 应中血红素氧合酶-1（HO-1）发挥着怎样的作用打下了基础。 关键词：藏羚羊；血红素氧合酶-1；低氧适应； cDNA 克隆； 序列分析 Abstract Cloning and Sequencing analysis of coding region of heme oxygenase-1 （HO-1）gene from Tibetan antelope（Pantholops hodgsonii） Tibeta