超声微泡介导基因转染防治移植静脉再狭窄的实验研究-外科学(心胸外科)专业论文.docx

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 1 PAGE 1 超声微泡介导基因转染防治移植静脉 再狭窄的实验研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏外科 博士研究生 胡 敏 导 师 张凯伦 教授 中 文 摘 要 第一部分 微泡造影剂结合超声介导绿色荧光蛋白质粒 转染血管平滑肌细胞的实验研究 目的 探讨超声微泡造影剂结合超声辐照能否提高增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒 （pEGFP）在大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）的转染效率，及其对细胞活性的影响。 方法 实验分为 A、B、C、D 四组，分别为空白对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+超 声辐照组、质粒+超声辐照+造影剂组。使用诊断超声仪照射体外培养的大鼠血管平滑 肌细胞，辐照条件为超声探头频率为 10 MHz，机械指数为 1.9，辐照时间为 10min， 添加或不添加超声微泡造影剂，pEGFP 浓度为 5μg/ml, 辐照后台盼蓝染色检测细胞 活性（生存率），48h 后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的转染表达率。 结果 A、B、C、D 四组的细胞生存率分别为（97.43±2.63）%、（97.52±1.64）%、 （96.83±2.31）%及（95.21±1.36）%，各组间无显著性差异（P0.05）；GFP 转染表 达率分别为（0.12±0.42）%、（1.31±0.71）%、（4.45±3.13）%及（21.48±2.16）%， D 组的 GFP 转染表达率与其余各组比较差异具有显著意义（P0.01）。 结论 造影剂微泡结合超声辐照能显著提高 pEGFP 在 VSMC 的转染效率，而对细胞 的活性基本无影响，可作为基因转染的一种有效方法。 关键词 超声；微泡造影剂；基因转染；平滑肌细胞 第二部分 微泡造影剂结合超声介导一氧化氮合成酶基因 转染血管平滑肌细胞的实验研究 目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧气化氮合成酶（eNOS）基因转染 体外培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）的可行性。 方法 实验分为 A、B、C、D、E 五组，分别为空白对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+ 微泡造影剂组、质粒+超声辐照组、质粒+超声辐照+造影剂组。用重组真核表达载体 pcDNA3.1-eNOS 经微泡造影剂及超声辐照介导转染体外培养的大鼠血管平滑肌细 胞，辐照条件为超声探头频率为 10 MHz，机械指数为 1.9，辐照时间为 10min，重组 真核细胞表达载体 pcDNA3.1-eNOS 5μg/ml。辐照 48h 后，采用 RT-PCR、Western blot 及免疫组化检测 VSMC 内 eNOSmRNA 和蛋白的表达。 结果 RT-PCR 检测质粒+超声辐照+造影剂组 eNOSmRNA 的表达最显著，IOD 比值为 (91.11±3.41)%，单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组、质粒+超声辐照组也有少量表 达，IOD 比值分别为(26.10±1.32)%、(31.42±2.43)%、(35.05±2.25)%，与 E 组相比 P0.05。 蛋白印迹分析 eNOS 蛋白表达，空白对照组有极少量表达，单纯质粒浸泡组、质粒+ 微泡造影剂组也有少量表达， IOD 比值分别为 (22.12±1.33)% 、 (25.42±2.41)% 、 (33.11±3.11)%；而质粒+超声辐照+造影剂组表达最明显，IOD 比值为(84.22±9.22)%， 与各组相比 P0.05。 结论 超声辐照结合造影剂微泡能显著提高 eNOS 基因在 VSMC 的转染效率，提高细 胞内一氧化氮合成酶的表达。 关键词 超声；微泡造影剂；一氧气化氮合成酶基因；平滑肌细胞 第三部分 微泡造影剂结合超声介导绿色荧光蛋白质粒 转染大鼠移植静脉的实验研究 目的 探讨微泡造影剂结合超声辐照介导基因转染移植静脉桥的可行性。 方法 建立 SD 大鼠颈外静脉-颈总动脉移植模型，选择增强型绿色荧光蛋白质粒 (pEGFP)为报告基因。将大鼠颈外静脉段浸泡入粘附质粒的微泡中，予超声照射，再 将静脉段间置植入颈总动脉，2d 后，取出静脉段行快速冰冻切片，荧光显微镜下观察 血管平滑肌内荧光表达，同时进行苏木精-伊红染色行病理观察。 结果 微泡造影剂结合超声辐照组的荧光强度显著高于质粒浸泡+超声辐照组、质粒+ 微泡造影剂组及单纯质粒浸泡组(P0.05)。苏木精-伊红染色观察血管组织并无坏死灶 的出现。 结论 微泡造影剂结合超声辐照可以实现基因靶向转染至大鼠移植静脉桥的血管平滑 肌中。 关键词 超声；微泡造影剂；基因转染；静脉桥 第四部分 微泡造影剂结合超声介导一氧化氮合成酶基因 转染防治移植静脉再狭窄的实验研究 目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧气化氮合成酶基因转染防治移植静 脉血管桥再