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茶树SCPL 生物信息机CsSCPL3功能的研究-茶学专业论文
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摘要
茶树中酯型儿茶素与非酯型儿茶素的区别仅在于C环3位上有无没食子基团。本 课题组前期研究表明,催化非酯型儿茶素没食子酰基化的酶是一种酰基转移酶,且该 酶可能属于丝氨酸羧肽酶类蛋白(SCPL)家族。为挖掘可能参与没食子酰基转移 功能的基因,本文首先利用生物信息学手段,对茶树转录组及基因组数据库中的 SCPL进行筛选、基序和进化树分析及功能预测。其次,利用RACE 技术,克隆 了茶树CsSCPL3基因全长,并利用荧光定量实时PCR、原核表达、酵母真核表达及 农杆菌介导的烟草异源植物表达等技术,对该基因的组织特异性表达和功能进行预 测。本论文研究旨在为茶树SCPL蛋白功能鉴定奠定基础。主要研究结果如下:
.参考拟南芥的分类方法,对来自茶树转录组及基因组测序数据库中 49 条 CsSCPLs 蛋白序列的基序和进化关系进行了分析和分类,结果表明,49 条茶树 CsSCPLs 可分 3 类,其中 9 条和 8 条分别属于 CladeIA 和 CladeIB 类蛋白;17 条和 15 条分别属于 CladeⅡ和 CladeⅢ类蛋白。与酰基转移相关的蛋白属于 CladeIA 类。
.采用 RT-PCR 技术,克隆了茶树 CladeIA 类中的 CsSCPL3 基因的全长序列。
CsSCPL3 的全长为 1686 bp,开放阅读框长度为 1413bp,预测其分子量 54.7 KD, 等电点 5.81。
3.对 CsSCPL3 蛋白进行了生物信息学分析,结果表明 CsSCPL3 具有 SC 族羧肽 酶中 S10 家族特有的高度保守的“α/β 水解酶折叠”结构;该蛋白包含了 1 个底物结 合位点、3 个催化作用保守区和多个 N-糖基化位点、及其 Ser-Asp-His 三联体催 化中心等 SCPL 家族的典型特征;预测 CsSCPL3 蛋白可能为分泌蛋白;该蛋白还 可能存在 4 种修饰方式,即 N-糖基化位点、蛋白激酶 C 磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ 磷酸化位点、以及 N-端豆蔻酰化位点。
4.实时荧光定量 PCR 结果显示,CsSCPL3 在芽、叶、茎和根中都有表达,其中在 叶中的相对表达量明显高于茎和根;在幼嫩的芽中表达量明显高于成熟叶。
5.构建了 pET32a-CsSCPL3 重组质粒进行原核表达,并研究了不同诱导温度、 不同诱导时间等条件对重组蛋白表达的影响。结果表明,CsSCPL3 基因的最佳诱导条 件为 37℃诱导 4h;目标蛋白条带的分子量为 70 KD,与预测大小相符,表达蛋白以 包涵体形式存在。
6.构建了pYES-dest52-CsSCPL3重组质粒进行真核表达,成功实现了CsSCPL3基 因在酿酒酵母中的表达,但未检测到酶活性。
7.构建了 pCB2004-CsSCPL3 重组质粒,利用农杆菌 EHA105 侵染烟草,获得了 转基因烟草。转基因烟草中的 CsSCPL3 功能有待进一步
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