茶树咖啡碱合成途径中疑似N-甲基核苷水解酶的原核表达及活性验证-食品加工与安全专业论文.docxVIP

PAGE PAGE IV 目 录 摘 要 I Abstract II 1 文献综述 1 1.1 咖啡碱的生理功能 1 1.2 低咖啡碱茶饮的研究进展 2 1.3 茶树体内咖啡碱合成途径研究 3 1.3.1 咖啡碱合成途径研究 3 1.3.2 茶树咖啡碱合成途径中相关酶的研究 4 1.3.3 天然低咖啡碱茶树品种基因研究 4 2 引 言 6 2.1 研究意义 6 2.2 技术路线 6 2.2.1 N-甲基核苷水解酶基因的克隆及表达 6 2.2.2 表达蛋白的活性验证 7 2.3 研究内容 8 3 材料与方法 9 3.1 材料 9 3.2 仪器与试剂 9 3.2.1 主要仪器设备 9 3.2.2 主要试剂盒 9 3.2.3 主要试剂配方 10 3.3 方法 11 3.3.1 茶树中候选 7-甲基黄嘌呤核苷水解酶基因的克隆 11 3.3.2 茶树候选 N-甲基核苷水解酶（STx）在大肠杆菌中的表达 11 3.3.3 表达蛋白的活性分析 16 3.3.4 7-MXR 的试制备 18 4 结果与分析 19 4.1N-甲基核苷水解酶在大肠杆菌中的表达 19 4.2 STx 酶的体外酶活性检测 20 4.2.1 以 XR 为底物的体外酶活性检测结果 20 4.2.2 混合 CaXMT 酶的体外酶活性检测结果 21 HYPERLINK \l _TOC_250001 4.3 STx 酶的体内酶活性检测 22 4.3.1 以 XR 为底物的体内酶活性检测结果 22 4.3.2 混合 CaXMT 酶的体内酶活性检测结果 23 HYPERLINK \l _TOC_250000 4.4 7-MXR 的试制备 24 5 结论与讨论 26 5.1 结论 26 5.2 讨论 26 参考文献 29 附录 A. 英文缩写及注释 32 附录 B. 茶树候选核苷酶 STx 及内参基因的核苷酸序列 34 致 谢 37 作者简介 38 PAGE PAGE 10 1 文献综述 1.1 咖啡碱的生理功能 咖啡碱（Caffeine，1，3，7-甲基黄嘌呤）是一种小分子的嘌呤碱。咖啡碱 在植物中广泛存在，目前已知，在全世界范围内，至少有 60 多种植物中含有咖 啡碱[1]，其中世界三大饮料性植物里，茶(Camellia sinensis)含有 2%-5%、咖啡豆 （Coffea arabica）含有 1%-2%、可可（Theabronma capana）含有 4%以下。在茶 树体内的生物碱中含量最高的既是咖啡碱，而可可碱、茶叶碱含量均远低于咖啡 碱，分别为 0.005%和 0.002%[2]。 咖啡碱是一种重要的植物次级代谢产物，存在于植物的各部分组织中，如嫩 叶、幼嫩茎、花和果实等，主要起到抗菌、杀虫等抵御外界入侵的作用[3-5]。 咖啡碱不仅在植物体中具有重要的生理功能，对动物特别是人体而言，也具 有多种生理功效。咖啡碱是一种中枢神经兴奋剂，适量服用能够刺激神经系统、 增强记忆力[6-9]，刺激呼吸系统、增加换气量和膈肌活力[10]，还能促进胰岛素分 泌，增加胃酸分泌等[11-12]，因此广泛应用于医疗、制药、饮食等领域。 由于具有多种生理功效，咖啡碱是世界上消费最广泛的精神类药物和饮食摄 入成分之一[13]。据报道，美国和加拿大的成人人均消费咖啡碱量达到 200-250mg， 英国更高达 300mg[14]。 同时，也有很多研究认为，长期大量摄入咖啡碱对人体有害。咖啡碱具有一 定依赖性和成瘾性，会刺激中枢神经、直接兴奋延髓，引起失眠、阵发性惊厥和 骨骼震颤，诱发呼吸道炎症、风湿关节炎等疾病，孕妇饮用过量可能导致婴儿畸 形或早产等[15-19]。 咖啡碱对动物体的作用具有多重水平，机制复杂，既有积极作用，也有负面 作用。一般认为，适量摄入咖啡碱对非孕妇、非儿童、无相关疾病的普通人体的 健康具有积极作用。据 Nawrot[20]等的研究，除孕妇和儿童外，普通人每天摄入 少于 400mg 的咖啡碱不会对人体构成明显伤害，即，平均 6mg/kg 体重的摄入量 是安全的。Hanna 等通过 9 年持续跟踪调查，认为咖啡碱摄入与心脏疾病和死亡 率间没有显著相关性[21]。 日常生活中，除药品外，饮食摄入咖啡碱途径主要是植物性饮料。以饮茶量 3-4g 计，若茶叶中咖啡碱达到最高（5%）且全部溶出，则摄入咖啡碱总量不超 过 200mg，而在实际的含量和浸出率下，咖啡碱总量远低于这个数字，且人体不 可能完全将其吸收，故对普通人而言，饮茶摄入的咖啡碱含量是十分安全的。 1.2 低咖啡碱茶饮的研究进展 随着生活方式的改变，现代社会有越来越多的人患有不同程度的心脑血管疾 病，加上生活压力的增大，很大程度地增