茶树中三个与茶尺蠖取食诱导相关的肉桂醇脱氢酶(CAD)基因克隆与功能分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

I I 摘 要 木质素是由多种简单的苯丙烷及其衍生物聚合形成的复杂聚合物，其通过 有效物理化学屏障在植物抵抗病、虫害侵入中起着重要作用。而肉桂醇脱氢酶 (CAD)是控制木质素生物合成途径的关键酶之一，然而茶树体内 CAD 基因相 关研究及其与抗虫性之间的关系研究至今未见报道。本论文主要对茶树叶片中 的三个与茶尺蠖取食诱导相关的 CAD 基因进行了 cDNA 克隆，鉴定和表达特 征分析。主要结果如下： 1．基于本课题组建立的茶树被茶尺蠖取食诱导前后的 cDNA 消减杂交文 库（SSH）和茶树全器官转录组库获得的 3 条与 CAD 基因同源性很高的 EST 序列，利用 RACE 技术分别克隆了编码 CAD 基因的全长 cDNA 序列，其中 1 条来自于 SSH 编码的 CAD 命名为 CAD2，2 条来自于转录组库编码的 CAD 分 别命名为 CAD1 和 CAD3。CAD2 基因全长为 1574bp，开放阅读框 972bp，编 码 324 个氨基酸；CAD1 基因全长为 1386bp，开放阅读框 1146bp，编码 382 个氨基酸； CAD3 全长为 1350bp，开放阅读框 1083bp，编码 361 个氨基酸。 并将三个基因的序列递交到 GenBank，登录号分别为 HM440158、HQ880207 和 HQ880208。 2．多序列同源比对和蛋白质结构预测分析表明， CAD1 和 CAD3 之间同 源性为 54%，而两者与 CAD2 同源性比较低，仅为 20%。只有 CAD1 和 CAD3 含有二者共有的 3 个保守的功能结构域：Zn1 结合位点[GHE(X)2(X)5G(X)2V]， Zn2 结 合 位 点 [GD(X)9.10C(X)2C(X)2C(X)7C] 和 NADPH 辅 酶 结 合 位 点 [GXG(X)2G]；仅 CAD2 含有依赖于 NADPH 的表异构酶/脱水酶家族的氧化还 原酶功能结构域。进化树分析结果表明，CAD1、CAD2 和 CAD3 分属于 3 个 不同的家族。 3．原核表达结果表明，CAD2 基因表达的蛋白大部分是分布于上清的可 溶性蛋白，分子量为 53 kD，而 CAD1 和 CAD3 基因表达的蛋白皆形成包涵体， 分子量分别为 59 kD 与 56 kD。酶活测定结果发现，三个 CAD 基因表达的蛋 白质具有不同的催化活性，其中以 CAD2 活性最高，为 0.43μmol·min-1·mg-1， CAD3 次之，为 4.2nmol·min-1·mg-1，CAD1 最小，为 3.8nmol·min-1·mg-1。 CAD2 的最适 pH 为 6，最适温度为 30℃，酶动力学参数 Km 为 1.974μmol·L-1， Vmax 为 1.7437μmol·min-1·mg-1。 4．利用 Southern blot 技术分析发现，茶树基因组中的 CAD1 和 CAD2 基 I II 因均以双拷贝存在，而 CAD3 基因则是以单拷贝形式存在。 5．茶尺蠖取食诱导 3 个 CAD 基因的表达量不尽相同，其中 CAD1 和 CAD2 间的诱导表达量的最大值差异不大，但是二者各自与 CAD3 的差别要明显大于 CAD1 和 CAD2 间的差异；三个基因的诱导表达量皆存在品种间差异，总体表 现为舒茶早大于龙井 43；从诱导表达规律上来说，三个基因也存在差异，CAD1 和 CAD2 表达量均是随着取食后时间增加而缓慢增加，最大值分别出现在 24 h 和 9-12h 之间，而 CAD3 是先急剧增加至最大值，紧接着急剧下降，最大值则 出现在 3-6 h 之间。而单独的机械损伤处理后，三个基因间的最大表达量差异 与茶尺蠖取食诱导的类似，但是品种间差异不显著。 通过外源激素诱导试验发现，茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）和脱落 酸(ABA)处理均能诱导 3 个 CAD 基因的表达上调，但是三者各自的最大表达 量随着激素种类的不同而存在差异，MeJA 和 SA 诱导 CAD1 和 CAD2 基因的 最大表达量要明显高于 CAD3，而 ABA 诱导 CAD1 与 CAD3 基因的最大表达 量均明显高于 CAD2 基因。 关键词：茶树；肉桂醇脱氢酶；茶尺蠖；基因克隆；功能特征 PAGE PAGE III Abstract Lignin is a complex polymer formed by Many simple phenylpropane and derivatives which plays a great role in organism. lignin consists of effective physical chemistry barrier that resis