3-2.单克隆抗体制备2014.pptVIP

阳性杂交瘤细胞的克隆化 克隆化 从抗体阳性孔中分离出单个细胞进行培养，使之繁殖成单一细胞集落的过程。 有限稀释法：最常用的方法 显微操作法 荧光激活细胞分选法 软琼脂平板法 有限稀释法 计数 103/ml 102/ml 10/ml 0.5-2/孔 将阳性孔细胞株稀释，重新平分到 96 孔细胞培养板中，以计算使得每孔中只含有一个细胞（例如 每 mL 含有100 个细胞，若只要取一个细胞放到一个培养孔中，那你应该吸取多少 mL？ 0.01 mL），待其生长成群落后，再次以 ELISA 筛选特异性抗体。 克隆化需至少进行3-5次 阳性杂交瘤细胞的冻存 目的：保证杂交瘤细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。 冻存液：10%-90%小牛血清+10%二甲亚砜（DMSO），1X106-5X106/0.5 mL 逐步降温:-800C过夜,再放入液氮 单克隆抗体生产 小鼠体内诱生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑选出来的杂交瘤细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后以 针头 收集所产生的 腹水，通常可取得 15 mL 左右；腹水中的抗体浓度非常高，每 mL 可达数 mg。? 2)体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。 单克隆抗体的性质鉴定 Ig类型测定 特异性测定 效价测定 结合表位测定 亲和力测定 染色体分析 单克隆抗体的特性 高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性 思考题 常用的细胞破碎方法有哪些？ 何谓佐剂？主要的作用机制有哪些？福氏佐剂的组成？ 什么是抗血清？制备的基本流程？单价特异性抗血清？ 何谓单克隆抗体？有何特性？杂交瘤技术的基本原理？ 为什么在HAT培养基上只有杂交瘤细胞能够存活？ 单克隆抗体的制备流程及应用？ 单克隆抗体制备技术 monoclonal antiboddy production 本章内容 单克隆抗体概念、特性、与多克隆抗体的异同点？ 杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤细胞的克隆方法 单克隆抗体的制备流程和应用 概念 多克隆抗体（PcAb）：针对抗原不同表位的多个B淋巴细胞克隆产生的混合抗体 单克隆抗体（McAb）：只针对抗原单一表位的B淋巴细胞克隆产生的同源抗体 为何要使用单克隆抗体？ 一个抗原分子可能含有许多抗原表位 一个B细胞只会生产一种抗体 传统抗血清对相似抗原会有交叉反应性 一个抗原分子上常有许多表位 抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段，称为eptope 、antigenic determinant；一个抗原分子上通常都有许多eptope ，每个eptope至少都可诱生出一种抗体；因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的eptope。 一个B细胞只会生产一种抗体 血清中的每一种抗体是由单一种 B 细胞 所分泌产生，若能把此 B 细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可获得单一种类的抗体，只会对一种 eptope反应。 大量培养此细胞株，即可有品质一定、纯度均一的抗体，即单克隆抗体。 抗血清对相似抗原会有交叉反应性 对于分子构造相似的抗原，由于它们含有共同或相似的eptope ，所产生的抗血清对这两种相似的抗原都会产生反应，称为交叉反应性。 同时又由于免疫动物的个体差异，对抗原的反应也有相当的差异，以致无法准确控制所得到每批抗血清 效价的高低 抗血清和单克隆抗体制备 B细胞无法在培养基中生长 B细胞不易在培养基中生長，虽然有人一直努力，想找出在体外培养脾脏细胞的条件，但结果均不甚理想。 (見 图 中央的 4 号B 细胞，X 表示无法培养) 肿瘤细胞可在培养基中永久生长 肿瘤细胞可在培养基中永久生长：若把瘤细胞永久生长的特性，利用细胞融合技术导入可生产抗体的 B 细胞 中，则得到可在培养基中永久生长的 B 细胞株，即杂交瘤细胞株。? 1975年Koehler和Milstein在Nature杂志联名发表题为“分泌预定特异性抗体的融合细胞持续培养“的论文，宣告单克隆抗体的诞生，该成果获1984年诺贝尔医学奖和生理奖. 杂交瘤技术制备单克隆抗体 杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤技术是将能够产生抗体，但在体外不能进行无限繁殖的B淋巴细胞与能在体外进行无限繁殖，但不能产生抗体的骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：既能够分泌特异性的抗体，又能够在体外长期繁殖。杂交瘤细胞经过筛选、克隆化培养后成为单个细