凡纳滨对虾血蓝蛋白相互作用蛋白的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

摘要 近年来，国内外学者研究证实对虾中存在多种免疫因子、多条免疫信号传导 途径，且不同的免疫因子之间、不同信号传导途径之间还存在重要的相互调控关 系。其中，血蓝蛋白（hemocyanin, HMC）是近年来在对虾等无脊椎动物体内新 发现的一种具有多种免疫活性的多功能蛋白，但迄今为止，其在对虾免疫调控网 络中的作用和地位等尚不清楚。为此，本研究采用蛋白质组学、分子生物学、分 子免疫学等策略对其进行了深入、系统的探究，所获主要研究结果如下： 1、对虾血蓝蛋白相互作用蛋白的鉴定 采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）、生物质谱（LC-MS/MS）等技术 获得与对虾血蓝蛋白相互作用蛋白 61 个，在此基础之上，进一步通过蛋白相邻 的聚簇（COG）、Gent ontology（GO）等蛋白注释分析以及 PATHWAY 数据库 筛选，发现 12 个免疫信号传导通路相关蛋白可能与血蓝蛋白相互作用。 2、对虾血蓝蛋白与谷氨酰胺转胺酶相互作用分析 为了进一步证实血蓝蛋白与其相互作用蛋白之间的相互作用关系，我们选取 血液凝结信号传导通路关键蛋白——谷氨酰胺转胺酶（transglutaminase, TGase） 为研究对象进行深入分析。 首先，采用基因克隆技术获得 TGase cDNA 全长序列（2274 bp），序列分析 显示，其含有 1 个 TGase 同源保守结构域和 3 个 Ig-like 区。继而，通过原核表 达、Ni-NTA 柱分离纯化 TGase 重组表达蛋白（rTGase，分子量为 115kDa）。最 后，运用 Far-Western-blotting、pull-down 等技术进一步证实 HMC 确实可以与 rTGase 相互作用，与免疫共沉淀和质谱鉴定结果一致。 3、对虾血蓝蛋白对 TGase 及凝结信号传导通路效应基因的调控关系研究 首先，采用 real-time PCR 比较分析病原胁迫下 HMC 和 TGase 基因表达的 相关性，结果显示，HMC 和 TGase 基因表达量均先上升再下降，呈正相关关系。 继而，对 HMC mRNA 干扰沉默，比较分析 HMC RNA 干扰前后 TGase 和 凝结蛋白（clotting protein, CP）基因表达的差异。结果表明，TGase 和 CP 在 HMC I 干扰后基因表达水平均比干扰前有不同程度的下降，提示 HMC 对 TGase、CP 有着直接或间接的调控关系；同时，HMC 干扰后对虾血淋巴的凝结功能明显下 降，这可能与 CP 表达量的下降有关，该结果进一步说明 HMC 和 CP 之间可能 存在调控关系。 最后，通过病原菌感染对虾，比较分析 HMC 干扰前后对虾抵御病原菌的情 况，结果表明，HMC 干扰组对虾的致死率比 HMC 未干扰组高；同时，注射重 组 HMC（rHMC）可在一定程度上提高对虾的存活率。 由此推测，血蓝蛋白有可能通过与 TGase 相互作用对 TGase 及其血液凝结 信号传导通路进行调控。 综上所述，本研究首次发现凡纳滨对虾血蓝蛋白可与 12 个免疫信号传导途 径相关蛋白发生特异性的结合，同时，对 TGase 及其血液凝结信号传导通路效 应基因 CP 表现出较好的正调控作用。所获结果对揭示血蓝蛋白在对虾免疫防御 调控网络中的地位具有重要意义，同时为对虾病害的免疫学防治提供了重要的科 学依据，促进对虾养殖业持续发展。 关键词：对虾；血蓝蛋白；相互作用蛋白；TGase；血液凝结信号传导通路；正 调控 II Abstract Recently, a variety of immune molecules and multiple immune signaling pathways have been characterized in shrimp, and their interaction was also identified. Hemocyanin (HMC), one of the important immune factors, was documented to act as a novel multifunctional protein with several immunologic activities in shrimp and other invertebrates. However, so far the mechanism of its immune regulation is still unclear. Thus, in this paper, an attempt was made to explore the regulation relationship between hemocyan