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红网纹草组织培养外植体消毒的方法的研究 　　摘 要：以红网纹草的顶芽、叶片、茎段为外植体，对其进行最佳消毒方法的研究。首先以叶片为外植体，筛选最适宜的次氯酸钠浓度和升汞浓度，即进行不同浓度次氯酸钠（1%，2%，5%）和升汞（0.05%，0.10%，0.15%）的单因素试验。继而进行外植体（顶芽，叶片，茎段）、2%次氯酸钠消毒时间（0，5，10 min）、0.10%升汞消毒时间（0，5，10 min）3因素3水平的L9（34）正交试验。结果表明：在单因素试验中，适合红网纹草外植体的次氯酸钠和升汞浓度分别为2%和0.10%；在正交试验中，茎段与叶片污染率相同，均低于顶芽，但茎段成活率最高，因而为理想的外植体，最佳的消毒方法是将茎段外植体在2%的次氯酸钠中消毒5 min，再在0.10%的升汞中消毒5 min。此种消毒方法污染率和死亡率最低为0，存活率最高为100%，是适宜红网纹草的最佳消毒方式。 　　关键词：红网纹草；组织培养；消毒方法；正交试验 　　中图分类号：S682.39 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.029 　　红网纹草（Fittonia verschaffeltii）是爵床科草本植物，叶脉红色网纹状，耐阴湿、喜温暖，是一种珍贵的室内观叶植物[1]。主要以扦插或分株法进行繁殖，因北方地区冬季气温低不易发根，只能在春、夏两季育苗。由于常规方法受季节影响较大，且繁殖速度太慢，不能满足市场需要[2]，因而可利用组织培养技术实现红网纹草的快速繁殖。 　　由于红网纹草茎段部位有较多纤毛，且叶背脉络较深，这为其组织培养中的外植体消毒带来一定困难，而有效的消毒方法是组织培养成功的前提和保障。不同植物材料、不同部位其消毒试剂和消毒时间不尽相同[3]。尽管近几年来国内开展了一些关于网纹草属的组织培养研究[1-2，4-9]，但仅局限于白网纹草[1-2，4-8]，关于红网纹草的组织培养研究仅有1篇[9]，尚未见关于红网纹草组织培养消毒方法的研究报道。本研究旨在筛选适宜红网纹草组织培养的外植体、消毒试剂和消毒时间，为红网纹草组织培养的无菌操作提供技术支持。 　　1 材料和方法 　　1.1 试验材料 　　试验材料红网纹草购自哈尔滨市花卉市场，选取生长健壮、无病虫害的顶芽、叶片、茎段为外植体。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 外植体的预处理 将剪好的外植体盛装于小烧杯中，先用洗衣粉水冲洗10 min，再用流水冲洗10 min，直至小烧杯中的洗衣粉泡沫冲洗殆尽。 　　在超净工作台上，将洗好的外植体移入已消毒的空瓶中，用75%的酒精浸泡30 s，不断摇晃容器使外植体充分接受酒精的杀菌作用。倒出酒精，倒入无菌水涮洗1次，然后按试验设计要求对外植体进行不同消毒试剂、不同时间的浸泡消毒。若消毒试剂为次氯酸钠，则用无菌水冲洗3次；若消毒试剂为升汞，则用无菌水冲洗5次，以充分消除残余升汞对外植体产生愈伤组织的抑制作用。 　　将已消毒的外植体置于铺有无菌滤纸的超净工作台上，使其充分吸收外植体表面的水分。剪掉顶芽外植体形态学下端与消毒试剂接触的部位，再将其剪成1 cm左右的小段；剪掉茎段外植体两端与消毒试剂接触的部分，再剪成1 cm左右的小段；剪掉叶片外植体四周与消毒试剂接触的部分，再剪成1 cm2左右的小块。将3种外植体接种于MS+6-BA 2.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1的诱导培养基（添加7.8%琼脂、25 g?L-1蔗糖）上，调节pH值至5.8～6.0。培养室温度25 ℃，光照强度3 000 lx，光照时间16 h?d-1。 　　1.2.2 单因素试验 筛选次氯酸钠和升汞的最适浓度：以红网纹草叶片为外植体，设置次氯酸钠1%，2%，5%和升汞0.05%，0.10%，0.15% 3个浓度水平的6组处理，每组处理均消毒10 min，每个处理30瓶，每瓶接种1个外植体，试验重复3次。30 d后，统计污染率、死亡率，筛选出最适合红网纹草的次氯酸钠和升汞浓度。 　　1.2.3 L9（34）正交试验 筛选适宜的消毒试剂和消毒时间：在单因素试验基础上，进行外植体（顶芽、叶片、茎段）、2%次氯酸钠消毒时间（0，5，10 min）、0.10%升汞消毒时间（0，5，10 min）3因素3水平的L9（34）正交试验[3]。按照表1、表2共进行9个处理，每个处理30瓶，每瓶1个外植体，试验重复3次。30 d后，统计污染率、死亡率、成活率，进而探究出红网纹草外植体的最佳消毒方法。 　　1.3 数据统计与分析 　　利用Microsoft excel软件制表，统计污染率、死亡率和成活率，利用SPASS统计分析软件进行方差分析，利用邓肯氏多重比较（Duncan’s multi