转P5CS基因马铃薯“东农303”耐盐抗旱性的研究.docVIP

转P5CS基因马铃薯“东农303”耐盐抗旱性的研究 　　摘要：利用拟南芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）进行了马铃薯品种“东农303”的遗传转化，在盐和干旱胁迫下研究转基因植株的耐盐性和抗旱性。经PCR扩增，证实P5CS基因已整合到马铃薯基因组中。用150mmol/LNaCl溶液和干旱（基质含水量为20%～25%）胁迫处理20d，发现转基因植株叶片的脯氨酸含量显著增加，SOD活性明显上升，而丙二醛积累量则缓慢，从而说明该品种更适合生长在干旱和盐胁迫条件下。 　　关键词：马铃薯；P5CS基因；耐盐性；抗旱性；SOD；丙二醛 　　中图分类号：S532.03文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0131-03 　　在干旱和盐碱土壤等逆境条件下生长的农作物，因受到渗透胁迫而严重影响其新陈代谢，造成大幅减产。据统计，全球干旱、半干旱地区约占陆地面积的34.9%，在我国，由于干旱引起的主要农作物减产量约为总产量的50%，盐碱地面积则高达9913.3万hm2，且有增加趋势[1-2]。植物体在一定范围的干旱和盐碱胁迫下，大量合成并积累脯氨酸、甜菜碱等有机化合物来调节渗透压，降低水势，完全或部分地维持细胞膨压，从而保证植物体内生理生化过程的顺利进行[3-4]。在渗透胁迫下脯氨酸主要来源于谷氨酸合成途径，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase，P5CS）是脯氨酸合成的关键酶，催化谷氨酸磷酸化并还原谷氨酸-γ-半醛，同时P5CS活性又受到脯氨酸的反馈调节。P5CS基因可被干旱、高盐和脱落酸诱导表达，对高温或低温诱导没有反应[5]。过量表达P5CS基因的烟草植株在干旱和盐胁迫下大量积累脯氨酸来维持其渗透压，在400mmol/L的盐胁迫下，转基因烟草植株根的干物质量增加[6]；转P5CS基因水稻实生1代的组织培养苗在100mmol/LNaCl胁迫下植株高度、鲜质量比对照植株均有明显增加；转豇豆P5CS基因水稻实生1代在田间干旱条件下积累大量脯氨酸，生长势明显优于对照植株，表明水稻实生1代可稳定表达外源P5CS基因，并具有抗干旱、抗盐碱能力[7]。在250mmol/L盐胁迫下，转P5CS基因水稻细胞系的鲜重比野生型高6～8倍，其脯氨酸含量为对照的241%[8]；转拟南芥P5CS基因大豆在干旱胁迫下能够快速积累脯氨酸，提高抗旱性；在正常供水条件下，转P5CS基因柑橘的脯氨酸含量与对照无明显差异，而在水分胁迫下，转基因植株脯氨酸积累量明显高于对照，抗旱性得到了较大增强[9]。上述试验均证明P5CS基因的转入能提高植物的抗逆性。 　　目前，我国东北地区土壤盐碱化面积日渐扩大，旱涝等非生物胁迫逆境环境也频繁发生，开发适合栽培于逆境土壤的抗旱、抗盐碱等抗逆性作物势在必行。马铃薯是常见的粮菜间作作物，生育期短、适应性强、产量高，具有较好的经济效益。本研究把拟南芥P5CS基因转入马铃薯品种“东农303”中，并在干旱和盐碱胁迫环境下测定了转基因植株体内脯氨酸、丙二醛的含量及SOD活性，为选育抗旱耐盐的马铃薯新品种奠定理论基础。 　　1材料与方法 　　1.1遗传转化受体材料及菌株 　　将消毒的“东农303”马铃薯微型薯切成10.0mm×10.0mm×1.5mm大小的薄片作为农杆菌转化的受体材料；菌株为含有pCAM-BIA-1301-P5CS质粒的LBA4404根癌农杆菌，由笔者所在实验室保存。 　　1.2农杆菌介导遗传转化 　　将受体材料浸泡于LBA4404农杆菌悬浮液（吸光度D600nm=0.3）20min，共侵染1000个外植体。侵染外植体置于再分化培养基（MS基本培养基+5.0mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+30g/L蔗糖+500mg/L羧苄青霉素+6mg/L潮霉素）中，在25℃、16h/d光照条件下培养，每15d继代1次。外植体在再分化培养基中约4周开始分化出芽，当再生芽长到20mm高度时，继代到抗性生根培养基上（MS基本培养基+30g/L蔗糖+500mg/L羧苄青霉素+10mg/L潮霉素），统计遗传转化率（遗传转化率=再生抗性植株/侵染外植体总数×100%）。 　　1.3PCR检测 　　取抗性植株叶片，用CTAB法提取植物总DNA，以引物P5CS-F（5′-GTTTTTGAATCCCGGCCTGA-3′）和P5CS-R（5′-TCCACTTGGCGGAGGAATAT-3′）检测P5CS基因。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；于72℃延伸7min，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 　　1.4胁迫处理材料培养 　　当转基因和非转基因试管苗长至8～10张叶时，将其切成