金太阳杏花粉超低温保存的方法的研究.docVIP

金太阳杏花粉超低温保存的方法的研究 　　摘　要：为探讨杏花粉种质保存的方法，进而为花粉培养、遗传转化和杂交育种提供材料，以杏品种金太阳的新鲜成熟花粉为试材，采用干燥法和玻璃化法2种超低温保存技术，对花粉干燥时间、解冻方式和贮藏时间等影响保存后花粉萌发率的有关因素进行研究。结果表明，干燥时间对金太阳杏花粉超低温保存后的萌发率有显著影响，其中干燥法宜在4 ℃下硅胶干燥8 h、玻璃化法宜在(20±1)℃下以玻璃化液PVS2(体积分数15％二甲基亚枫+15％乙二醇+30％甘油+0.4 mol/L蔗糖)处理60 min；干燥法保存后分别以4℃2 h、20℃30 min和40℃70 s等3种方式化冻．花粉萌发率无明显差别，而对玻璃化法则以40℃70 s化冻后的花粉萌发率最高；以2种方法分别保存1、lO、30、60d后花粉萌发率无显著变化。 　　关键词：杏；花粉；干燥法；玻璃化法；超低温保存 　　中图分类号：$662．2 文献标识码：A 　　文章编号：1009-9980(2007)05-689-03 　　 　　超低温保存技术是目前长期稳定保存植物种质资源较为理想的方法，它是指在超低温(通常是指液氮温度，-196℃)条件下，细胞的全部代谢活动近于完全停止，因而可以保持种质的遗传稳定性，达到长期稳定保存的目的。自1973年Nag等首次在液氮中成功保存胡萝卜悬浮细胞以来，植物种质资源超低温保存技术已在许多植物材料如原生质体、愈伤组织、体细胞胚、茎尖分生组织、芽、花粉等组织和器官保存试验中取得成功。花粉具有体积小、携带方便的特点，成熟花粉包含着植物的遗传信息，随着花粉单倍体育种、花粉遗传转化等工作的开展，对花粉保存的研究愈加受到重视。目前已有柿、枇杷等超过10种果树花粉应用超低温保存技术取得成功，但对杏花粉用玻璃化法进行超低温保存的研究尚未见报道。试验以杏品种金太阳花粉为材料进行超低温保存研究，以期能为杏花粉的种质保存、进而为花粉培养、遗传转化和杂交育种研究提供参考。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1 材料 　　试验于2006年在河南农业大学园艺植物实验室进行。材料为河南农业大学科教园区种植的4 a生杏品种金太阳(Prunus armeniaca Linn．cv．Sun―gold)，3月中旬在晴天上午采集生长健壮的植株的含苞待放的花蕾，带回室内用镊子摘除花药，平摊于硫酸纸上，室温下自然晾干20 h，收集散出的花粉．双层塑料薄膜包裹，置于4℃冷藏箱中贮藏备用。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1 干燥法保存步骤于4 cC条件下，将花粉等量放入2 mL冻存管内(每管装载容积的1/3)，敞开管口垂直放于干燥器内，以硅胶(4 L干燥器中加入l kg硅胶)干燥不同时间(0、2、4、6、8、12、16 h)后，取出冻存管将不同处理时问的花粉分为2部分，一部分加上冻存管盖后投入液氮(-196 ℃)中，保存不同时间(1、10、30、60 d)后取出，用不同温度和不同时间(4℃2 h、20℃ 30 min、40℃70 s)解冻后，分别检测花粉萌发率，以另一部分不经液氮保存的花粉为对照。 　　1．2．2玻璃化法保存步骤 于室温(20℃)条件下，将花粉等量放入2 mL冻存管中，以植物玻璃化液PVS22体积分数15％二甲基亚枫+15％乙二醇+30％甘油+0.4mol/L蔗糖)处理不同时间(0、10、20、40、60、80、100 min)后，一部分迅速投入液氮(-196℃)中，保存(不同时间设置同1．2．1)后取出解冻(方法同1．2．1)后，以1.0 mol/L蔗糖液洗涤2次，每次8 min，分别检测花粉的萌发率，以另一部分不经液氮保存的花粉为对照。 　　1．2. 3花粉萌发率的检测方法采用糖液发芽法，将干燥法保存过的花粉在室温和100％相对湿度下复水30 min，玻璃化法保存过的花粉用蒸馏水洗去表面糖液后，均匀散播于萌发培养基(体积分数15％蔗糖+1％琼脂)，培养温度为(25±0.5)℃，培养2.5 h后在显微镜下观察花粉萌发状况，统计花粉萌发率(以花粉管长度大于花粉粒直径为存活标准)。试验采用完全随机设计，3次重复，调查花粉萌发率时每小区测定花粉量100粒。 　　 　　2 结果与分析 　　 　　2．1 干燥时间对用2种超低温保存方法保存花粉萌发率的影响 　　用干燥法对金太阳杏花粉超低温保存的结果从表1中可以看出，随硅胶干燥处理时间的延长，未经液氮保存的花粉萌发率逐渐降低，而经液氮保存的花粉生活力则先升高又降低，其中干燥时间为8 h时，萌芽率最高为72.4％，显著高于其它处理。原因可能为，未经液氮保存的花粉，随干燥处理时间的延长，含水量迅速降低，花粉的萌发率也随之下降，而经液氮保存的花粉，当干燥一定时间，到达花粉