银川市食源性单增李斯特菌分子流行病学特征的研究.docVIP

银川市食源性单增李斯特菌分子流行病学特征的研究 　　【摘要】[目的]了解银川市食品中分离的单增李斯特菌的分子流行病学特征，为李斯特菌病的暴发溯源提供理论依据。[方法]用PCR方法对41株单增李斯特菌的LIPI-1毒力岛进行毒力基因检测；采用PulseNet方法对单增李斯特菌进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型。[结果]41株单增李斯特菌有12株具有毒力基因缺失现象，actA基因缺失情况最严重，缺失率为24.39%（10/41）%；41株菌分为5个不同的血清型和18个PFGE型别。1/2a（46.67%）和1/2c（44.44%）是优势血清型。7型是优势PFGE型别（34.15%）。[结论]银川市食源性单增李斯特菌的毒力基因缺失不严重，部分食品潜在危险较大，分子型别呈现多态性，未发现单个基因型菌株流行的迹象。 　　【关键词】单核细胞增生李斯特菌；脉冲场凝胶电泳；分子分型；毒力因子. 　　【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）05-0089-01 　　基金项目：北方民族大学校级科研项目：宁夏滩羊肉中主要食源性病原微生物的污染情况研究（2013XYZ034）；宁夏自然科学基金：宁夏食源性疾病暨腹泻病溯源平台建立与应用研究（NZ13220）。 　　单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM，单增李斯特菌）是一种重要的极具威胁的食源性病原菌。20世纪80年代以来，单增李斯特菌中毒的事件屡见不鲜，在美国、加拿大、德国、瑞士、意大利等国曾多次暴发发流行，迫使各国政府和食品工厂采取行动以大幅降低单增李斯特菌发病率。在欧洲单增李斯特菌引起的食物中毒事件不断增加[1]。2011年美国爆发了由单增李斯特菌引起的“毒香瓜”事件，共报告病例109例，死亡21例，涉及到美国24个州，这是10多年来美国最严重的一起食源性疾病暴发事件。 　　我国尚未报道关于单增李斯特菌引起的大规模中毒事件，但我国各地食品中普遍存在李斯特菌的污染情况，也存在人和动物感染李斯特菌病的病例。福建和云南等省曾多次报道该菌在禽兽中引起暴发的事件。2000年-2009年，我国16个省份中有一半有李斯特菌病例报告，病例共计92例，临床表现主要是败血症，平均病死率为21%[2]。 　　单增李斯特菌毒力基因在自然状况下会出现缺失，某些基因的缺失会导致单增李斯特菌的毒力明显下降，国内外学者纷纷对食品中单增李斯特菌毒力基因缺失情况进行研究报道[3]。但宁夏地区食品中单增李斯特菌毒力基因分布与缺失情况尚不清楚，毒力基因缺失与地区差异有无关系也尚未可知。此外，将单增李斯特菌进行有效分型对于流行病学调查、食品加工厂污染物溯源追踪及确定不同菌株之间的进化关系至关重要。本研究对银川市食品中分离的单增李斯特菌的进行毒力基因检测及分子分型分析，以期了解宁夏银川市单增李斯特菌的分子流行病学特征，为李斯特菌病暴发的病原溯源和风险评估提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1试验菌株 　　2013年银川市食品中分离单增李斯特菌41株。分离自生羊肉、生牛肉、生鸡肉、生猪肉、动物性水产品和速冻米面制品中；单增李斯特菌标准菌株CMCC54004和英诺克李斯特氏菌菌株（由宁夏疾病预防控制中心提供）；Marker菌株：沙门氏菌H9812（由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供）。 　　1.1.2 主要试剂与培养基 　　溶菌酶（德国Sigma公司）；琼脂糖（西班牙Biowest公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（北京天根生化科技有限公司）；Premix Taq Version 2.0（Loading dye mix）（大连宝生物工程有限公司）；TSA（Tryptone Soya agar）（OXOID公司，英国）；SeaKem Gold琼脂糖（Lonza公司，USA）；溶菌酶（Sig ma公司）；蛋白酶 K（Sig ma公司）；限制性内切酶AscI（NEB公司）；限制性内切酶Xpa（TaKaRa公司）；单核细胞增生李斯特菌血清（日本生研株式会社）。 　　1.1.3 主要仪器设备 　　脉冲场凝胶电泳仪及配套设备（美国Bio-Rad公司）；恒温水浴箱（德国JULABO公司）；比浊仪（法国梅里埃公司）；水浴摇床（德国JULABO公司）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；PCR仪（美国MJ公司）；电泳仪（北京六一厂）；凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。 　　1.2方法 　　1.2.1 血清分型试验方法 　　按照单增李斯特菌血清使用说明书，用单增李斯特菌血清，通过玻片凝集法（O抗原）和试管凝集法（H抗原）进行血清分型。 　　1.2.2 单增李斯特菌DNA的提取