黄芪黄酮干预脾虚水湿不化大鼠血浆代谢组学的研究.docVIP

黄芪黄酮干预脾虚水湿不化大鼠血浆代谢组学的研究 　　摘要采用高效液相色谱结合飞行时间质谱检测正常大鼠、脾虚水湿不化证大鼠及黄芪黄酮组分干预后大鼠血浆内源性代谢物变化，获取大鼠血浆代谢图谱，研究黄芪黄酮组分干预脾虚水湿不化证的作用机制。采用高脂低蛋白饮食加负重游泳力竭建立脾虚水湿不化证大鼠模型，选择HaloC18色谱柱，流动相为0.05%甲酸水与0.05%甲酸乙腈，梯度洗?，利用液相色谱串联质谱分析测定大鼠血浆样品。利用主成分分析法对造模前后大鼠血浆样本进行代谢轮廓分析，结合变量投影重要性及显著性分析等筛选对分组贡献最大的差异标志物及相关通路，阐明药物的作用机制。结果表明，黄芪黄酮组代谢轮廓异于模型组，而接近于正常组，共鉴定出了包含甘油磷脂类、鞘酯类、氨基酸类等在内的11种潜在生物标志物，其代谢通路包括三羧酸循环、甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢及氨基酸代谢等，主要涉及体内能量代谢和脂肪代谢。黄芪黄酮干预脾虚水湿不化证大鼠后，宏观指标（如体重、自主活动）和微观指标（如代谢标志物、血脂）均明显回调，表明黄芪黄酮可能主要通过调节能量代谢、脂肪代谢等途径而发挥健脾利水作用。 　　关键词黄芪黄酮；脾虚水湿不化证；代谢组学；高效液相色谱飞行时间质谱 　　1引言 　　黄芪为临床传统用药，始载于《神农本草经》，具有健脾补中，利水消肿等功效[1]。脾虚证是一组能比较集中反映脾各种生理功能不足表现的综合征候群，临床多采用益气健脾法治疗。黄芪为“补益脾气之要药”，故在临床上主要用于治疗脾虚发热[2]、脾虚肠易激综合征[3]及其它各种脾虚疾病[4]，但目前其药效的物质基础及作用机制尚不明确。 　　黄芪化学成分多而复杂，主要包括皂苷、黄酮及多糖类。近代药理研究结果表明，黄芪黄酮具有改善胃肠功能[5]促进水液代谢[6]、降低血脂、健脾[7]及抗肿瘤[8]等功效。本课题组前期研究结果也表明黄芪黄酮组分对脾虚水湿不化证大鼠一般状况、血脂等指标均有不同程度的治疗作用[9]，表明黄芪黄酮组分可能是黄芪发挥健脾利水作用的物质基础。 　　目前，文献报道的黄芪及其主要活性成分治疗疾病作用机制的研究几乎都是从药理作用及分子角度出发。近年来，随着代谢组学的快速发展[10～13]，越来越多的研究采用代谢组学方法阐释中药及复方药治疗脾虚证的机制。陈磊等[14]利用代谢组学方法研究了补中益气汤治疗脾虚的作用机制。但目前尚无从黄芪黄酮等活性成分角度对治疗脾虚水湿不化证的作用机制进行研究的代谢组学研究报道。本研究从代谢组学角度出发，利用高效液相色谱飞行时间质谱结合模式识别技术分析鉴定了黄芪黄酮组分干预前后脾虚水湿不化证大鼠血浆内源性代谢物，初步探讨黄芪黄酮组分治疗脾虚水湿不化证的作用机制，为进一步研究黄芪健脾利水的物质基础及深入探寻其作用机制提供科学依据。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　Agilent1260高效液相色谱（美国AgilentTechnologies公司），配有在线真空脱气机、四元泵、柱温箱和检测器；Agilent6230飞行时间质谱仪（美国AgilentTechnologies公司），配有ESI离子源和在线MassHunter数据采集处理系统；VORTEXGENIE2涡旋仪（美国SI公司）；凯特TD5A离心机（盐城凯特实验仪器有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia公司）；实验用水为超纯水，由美国Millipore公司的MilliQ系统制得。 　　2.2实验动物 　　健康Wistar大鼠30只，体重（150±20）g，雌雄各半，购自鲁抗医药集团股份有限公司实验动物中心（许可证编号SCXK。 　　2.3实验药物 　　黄芪黄酮组分制法及含量测定：采用传统水煎煮法，浓缩液经80%乙醇沉淀，取上清液回收至无醇味，乙酸乙酯萃取，制备黄芪黄酮组分。HPLCPDA含量测定，色谱柱为ZORBAXSBC18柱（250mm×4.6mm，5μm，美国Agilent公司）；流动相A：乙腈，B：0.1%甲酸，流速：0.5mL/min，线性梯度洗脱：0～10min，5%A；10～30min，5%～40%A；30～60min，40%～70%A；60～70min，70%～100%A。进样量：10μL，PDA检测波长：254nm。结果测得毛蕊异黄酮含量7.78mg/g，毛蕊异黄酮苷含量4.88mg/g，芒柄花苷含量3.80mg/g，芒柄花素含量4.79mg/g。 　　2.4大鼠造模方法，评价指标及分组给药 　　Wistar大鼠适应性饲养1周，随机分为正常组（10只，雌雄各半）和实验组（20只，雌雄各半）。正常组以纯化饲料饲养，实验组依据《中药治疗脾虚证的临床研究指标原则》和《中医湿病学》[15，16]?