腾冲菌脂肪酶的表达纯化及酶学性质的表征研究开发.PDFVIP

化 工 进 展 2014 年第33 卷第12 期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS ·3337 · 研究开发 腾冲菌脂肪酶的表达纯化及酶学性质的表征 李迅，仲惠，王亮亮，邓若冰，高红，王飞 （南京林业大学化学工程学院，江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，江苏南京 210037 ） 摘要：将来自腾冲菌的脂肪酶（LipA ）基因（lipA ）克隆到大肠杆菌表达载体pET28a （含T7 启动子）和pTrc99A （含Trc 启动子）中，转入大肠杆菌表达，发现Trc 启动子更适合LipA 的表达。通过热处理和DEAE-Sepharose 阴离子柱纯化过程，重组LipA 得到纯化，比酶活达到 1.9U/mg，重组LipA 分子量为42kDa 。重组LipA 在 80 ℃、pH 4.5 时酶活最高，经85℃保温2h ，酶活保持60%以上；在pH 值4.0～6.0 之间，LipA 具有较好的稳定性； Cu2+和Zn2+对酶活力分别有 38.9%和 69.2%的抑制作用，Mn2+ 、Co2+和Tween-20 对该酶有较大的激活作用；以 p -nitrophenyl-laurate (p- NP-C 12)为底物时，该酶的Km 值为 1.5mmol/L，kcat 为34.5s−1。 关键词：腾冲菌；脂肪酶；酶学性质；对硝基苯十二酸酯 中图分类号：Q 556+ .1；Q 786 文献标志码：A 文章编号：1000 –6613 （2014 ）12 –3337 –05 DOI ：10.3969/j.issn.1000-6613.2014.12.034 Expression，purification and characterization of lipase from Thermoanaerobacter tengcongensis LI Xun ，ZHONG Hui ，WANG Liangliang，DENG Ruobing ，GAO Hong ，WANG Fei （College of Chemical Engineering，Jiangsu Key Lab of Biomass-Based Green Fuels and Chemicals，Nanjing Forestry University ，Nanjing 210037 ，Jiangsu ，China ） Abstract ：The lipase from Thermoanaerobacter tengcongensis (LipA) is a kind of ester-bond hydrolysis enzyme catalyst of triacylglycerol. The LipA genes (lipA) were cloned into pET28a (T7 promoter) and pTrc99A (Trc promoter) ，yielding pET28a-lipA and pTrc99A-lipA ，and transformed into the Escherichia coli BL21 (DE3) and Top10 ，respectively. The strain harboring pTrc99A-lipA produced more recombinant LipA than the strain harboring pET28a-lipA. The recombinant LipA was purified to homogeneity from E. coli by a simple two-step procedure i