绿脓杆菌外毒素A基因的密码子优化、脱毒改造与其特性的-研究.pdf

摘要 exotoxin A，PEA)是由假单胞菌属绿 绿脓杆菌外毒素A(Pseudottlona$aeruginosa 脓杆菌(Pseudomonas 而失活，导致蛋白质的生物合成受阻，从而对细胞产生毒性作用。利用PEA的这一毒性 作用，将其与靶向蛋白(抗体或靶细胞膜受体配基)连接或融合制成的免疫毒素被广 泛用于癌症的靶向治疗。PEA除具有上述细胞毒性作用外，还具有较强的免疫原性， 它不仅可作为疫苗蛋白，也是一种重要的疫苗佐剂和疫苗载体。然而由于天然PEA的细 胞毒性较强，不能直接作为疫苗佐剂和载体应用于疫苗的生产，必须通过基因工程方 法对其进行基因改造使其毒性降低或完全脱毒才能应用。 为提高PEA基因在大肠杆菌中的表达水平和获得脱毒的PEA基因，我们首先利用 依据该基因的序列，利用大肠杆菌偏爱的密码子对PEA编码基因进行了全序列优化改造 模板，根据PEA蛋白的结构特点，在PEA蛋白的氨基酸序列中选定若干位点，通过核苷 酸介导的定点突变方法对选定位点氨基酸的编码基因进行定点突变，从而得到若干PEA 突变体的原核表达载体。将各种突变体表达载体转化大肠杆菌进行表达，用与上述同样 的方法分离纯化和鉴定重组PEA蛋白。最后利用小鼠成纤维细胞L929检测不同PEA突 变体对细胞的毒性作用，从中筛选出毒性低的PEA突变体。 实验结果表明，经过密码子优化，PEA编码基因发生402个碱基的取代，GC含 量由原来的69．8％降至52．2％，下降了33．7％。蛋白表达结果显示，密码子优化型PEA 的表达量(78．7±2．5 mg／L)明显高于未优化的表达量(39．O±2．0mg／L)(P0．01)， 表达水平提高了近1倍。细胞毒性实验表明，密码子优化的PEA基因制备的重组蛋白 对培养的动物细胞L929有明显的毒性作用，说明该蛋白具有天然生物活性。经过定 能在大肠杆菌中进行分泌表达。表达的PEA重组蛋白经Ni．NTA琼脂糖纯化，作用 于L929细胞显示出不同的细胞毒性，通过比较得出12个低细胞毒性的PEA突变体， 并最终从中选取3个毒性较低的突变体用于下一步的研究，从而为PEA蛋白在疫苗佐 剂与载体上的研究和应用奠定了基础。 关键词：绿脓杆菌外毒素A；密码子优化；定点突变：脱毒改造；原核表达 ofcodon ofPseudomonasexotoxinA Study optimization，detoxicafionaeruginosa anditscharacteristics gene Graduate Student：WangXingxing Fei Supervisor：．Prof．Zhong medicine Major：．Basicveterinary Abstract Pseudomonasexotoxin anumberof ofbacterial aeruginosaA(PEA)is family andan causativeofPseudomonas toxins aeruginosa．It ADP-ribosylatingimportant agent carl the factor cellsandinhibit