pSNAV2TGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达　.docVIP

PSNAV2CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达 】目的构建含人结缔组织生长因子(CTGF)的腺 相关病毒(AAV )表达载体，并观察其在人胚肾293 (HEK293)细胞中的表达。方法以含有人CTGF基因序列的 质粒pCMV?SP0RT6为模板，应用PCR克隆出CTGF基因，采 用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体上构建重组 质粒pSNAV2?CTGFo把重组质粒转染HEK293细胞，用免疫 荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究，MTT法检测细 胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。结果成功构建完 全正确的CTGF基因序列的A AV表达载体p SNA V2?CTGF，将 其转染HEK293细胞后，免疫荧光检测到目的蛋白的表达， 转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活 性。结论成功构建了真核表达载体pSNAV2?CTGF，转染HE K293细胞后能够表达具有生物学活性的C TGF蛋白。 关键词】结缔组织生长因子腺相关病毒质粒基因转 染椎间盘 [A BSTRACT ] Obj ectiveToco n structare co mbinantp las midofad enoa ssocia tedvi rus (A AV)exp ress ionvect orc ontainin gh umanconne c tivetissue growthfacto r(CTGF)andt ostudyitse x pressioni nh umanembr yon ickidne y293 cells(HEK29 3). Me thodsC TGFg enewasc Ion edfrompC MV ?SPORT6by P CR, thenlig atedwithtof ormrecombin antplasmid p SNAV2?CTG Fa ndtransd net edintoH EK29 3cells . Immu noflu oresce ncew asusedt ode teetthes yn thesisofC T GFproteini ntheHEK293c ells, MTTwas usedtodete c tthebiolo gi calactiv ity ofCTGFi nthe supern atant ofcul tureme dium aftertr ans fection. Re sultsAper f ectCTGFgen ewasligated toaftertran sfectedint o HEK293cel Is，theexpr ess ionofCT GFpr oteinw asobs erved anddet ecte dbyimmu nof luoresce nc e. Thecond i tionedmedi umaftertran sfectionsho wedthebiol o gicalacti vi tyofstim ula tingthe prol iferat ionof fibro blast. Cone lusionT hee ukaryoti ce xpression v ector, pSNA V2?CTGF, isc onstructed, whichcanex p ressCTGFp ro teinwith bio logical acti vityaf tertr ansfe ctionw ithH EK293ce 11s . [KEYW 0 RDS ] connec tivetissueg rowthfactor :adenoasso c iatedviru s; plasmid; tra nsfecti on; i nterve rtebr aldis c 结缔组织生长因子（CTGF）是一种富含半胱氨酸的分 泌性多肽，是CCN（C TGF、CeflO/c yr61和Nov的缩写）家族 中的成员，参与很多正常的生理过程，如受精卵的植入、 胎盘形成、胚胎发育，也参与一些病理过程如伤口愈合、 纤维变性等［1 ］。CTGF还可以刺激许多细胞合成细胞外基 质（ECM）蛋白。在纤维化疾病如肝纤维化、肾纤维化、肺 纤维化等已经对其进行了大量研宄，但其在椎间盘领域中 的研究还处在起步阶段。为了研究其在逆转腰椎间盘退变 过程中的作用，本研宄构建了重组质粒p SNAV2?CTGF，并 对其在人胚肾293 （HEK2 93）细胞中的表达进行观察。 1材料和方法 材料 携带人 CT GFcDNA 的 pCMV 9SP0RT6 质粒购于Openbiosy st ems公司，腺相关病毒（AAV）表达载体购于本元正阳公 司，HEK2 93细胞由青