免疫细胞的分离与功能测定5.pptVIP

免疫细胞的分离与功能测定 一 外周血单个核细胞的分离 原理: 密度梯度离心， 利用密度为1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层液（聚蔗糖-泛影葡胺） 主要步骤 1 无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml 125～250U /ml 肝素溶液） 2 用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.2～7.4 PBS 稀释 3 按每10ml稀释血用3～5ml淋巴细胞分层液的比例先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液 4 2000r/min 水平离心30min， 5 吸取分层液与血浆交界部位的单个核细胞，用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000 r/min，1500 r/min离心10min 6 用完全RPMI-1640定容，计数。一般每ml健康成人血可分离出1×106～2×106单个核细胞 7 台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应﹥95﹪。 注意事项 1 严格无菌操作 2 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀 3 淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后待温度升至室温使用 4 如须保存血浆作他用，则不能稀释血液 5 离心最适温度18～20℃ 6 分离组织中的单个核细胞也可采用上法 二 淋巴细胞的纯化 ㈠红细胞的去除 1 低渗裂解法 1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（