泛素连接酶Hrd1促进α1-抗胰蛋白酶Z突变体降解及细胞存活-药理学专业论文.docx

安徽医科大学博士学位论文 安徽医科大学博士学位论文 6 6 们首先考虑 Hrd1 通过 UPP 途径促进 ATZ 的降解。内质网中的蛋白底物经过 UPP 降解时首先被泛素化修饰，然后经过逆向转运到达 26S 的蛋白酶体，被蛋白酶体 中的蛋白水解酶降解。为了明确 UPP 是否参与了 Hrd1 介导的 ATZ 降解，我们观 察了 Hrd1 对 ATZ 泛素化的影响。结果发现在没有蛋白酶体抑制剂 MG132 存在 的情况下，Hrd1 可明显降低多聚泛素化 ATZ；在细胞的培养上清液中加入 MG132， 作用 4 hrs 后收集细胞，共转染 ATZ 和野生型 Hrd1 组出现多聚泛素化 ATZ，而单 独转染 ATZ 或者共转染 ATZ 与 Hrd1C1A 组则没有观察到明显的 ATZ 泛素化。 该结果提示 Hrd1 可以促进 ATZ 的泛素化，这种作用也是 E3 活性依赖的。 7．含缬酪肽蛋白( val osi n- cont ai ni ng pr ot ei n, VCP) 参与 Hr d1 介导的 ATZ 降解 ATZ 是内质网 (endoplasmic reticulum, ER) 腔内的蛋白，如果经过 UPP 降解， 需要从 ER 逆向转运至细胞浆，然后由 26s 蛋白酶体降解，即所谓的内质网相关蛋 白降解（ER-associated degradation, ERAD）。在 ERAD 过程中，VCP 在蛋白底物由 ER 转运至细胞浆的逆向转运中起着重要的作用。我们进一步观察了 VCP 是否也 参与 Hrd1 介导的 ATZ 降解。我们共转染 ATZ，Hrd1 和 VCP 的突变体 VCPQQ 的 cDNA。结果显示，与对照组相比，VCPQQ 阻碍了 Hrd1 介导的 ATZ 降解，提 示 VCP 参与了 Hrd1 介导的 ATZ 的降解。 8. 溶酶体通路可能参与 Hr d1 介导的 ATZ 降解 为了观察溶酶体通路是否参与 Hrd1 介导的 ATZ 降解，我们共转染 ATZ 和 Hrd1， 观察溶酶体膜稳定剂氯化铵对 ATZ 水平的影响，发现加入氯化铵后，出现高分子 量 ATZ 的聚集。我们同时构建了在 ATZ 的信号肽前方加入带有绿色荧光蛋白 (green fluorescence protein, GFP) 标签的 ATZ 表达载体，改变 ATZ 在细胞内质网中 的定位。将表达 GFP-ATZ 和 Hrd1 的质粒共转染 HEK 293T 细胞，设立共转染 GFP-ATZ 和空载体、GFP 和 Hrd1 及 GFP 和空载体的对照。24 hrs 后荧光显微镜 观察，与对照组相比，共转染 Hrd1 组 GFP-ATZ 绿色荧光强度明显降低；流式细 胞检测同样发现，共转染 Hrd1 后，GFP-ATZ 的荧光强度降低。而在转染 GFP 的 PAGE PAGE 7 对照组中，Hrd1 对 GFP 的荧光强度没有明显影响，IB 结果也显示 Hrd1 不能降低 细胞上清和沉淀中 GFP 的表达水平。 9．Hr d1 和 ATZ 存在相互作用 前述实验结果提示 Hrd1 可以通过 UPP 促进 ATZ 的降解。我们进一步观察 了 ATZ 与 Hrd1 之间是否存在相互作用。共转染 ATZ 和 Hrd1 或 Hrd1C1A 的 cDNA，免疫荧光双标结果显示 ATZ 与 Hrd1 在细胞内存在共定位。免疫共沉淀 结果提示 ATZ 与 Hrd1 及 Hrd1C1A 均存在直接的相互作用，该结果提示 ATZ 与 Hrd1 的相互作用与其 E3 活性无关。为了进一步证实 ATZ 和 Hrd1 之间的相互作 用，我们构建载体，将 ATZ 和 Hrd1 的 N 端分别连上荧光素酶的 C 端和 N 端。PCA 实验观察共表达两种重组载体的细胞的荧光素酶活性。与对照组相比，实验组荧 光素酶活性明显增高。该结果进一步证实 Hrd1 和 ATZ 之间存在相互作用。 10．Hr d1 降低 ATZ 的细胞毒性 ATZ 的聚集可以引起肝细胞毒性，我们在体外 HEK 293T 和 HepG2 的细胞模 型中同样观察到 ATZ 具有细胞毒性。同时我们观察了 Hrd1 介导的 ATZ 降解对 ATZ 细胞毒性的影响。免疫荧光结果显示单独表达 ATZ 的细胞或者共表达 ATZ 与 Hrd1C1A 的细胞变圆、突起缩短、细胞核分叶、固缩、碎裂或消失；共表达 Hrd1 后，细胞形态和细胞核趋于正常。统计分析 ATZ 阳性细胞核的完整性结果显示， Hrd1 的表达有助于维持 ATZ 阳性细胞核的正常形态；TUNEL 染色结果同样显示 共表达 Hrd1 后，细胞凋亡减少，而 Hrd1C1A 没有这种作用；提示 Hrd1 可以降低 ATZ 的细胞毒性，