经静脉神经干细胞移植治疗难治性癫痫实验探究.docVIP

经静脉神经干细胞移植治疗难治性癲痫实 验探究 132100吉林省吉林市中心医院神经内科 目的：观察难治性癲痫模型静脉注射骨髓基质细 胞后行为学及细胞形态学的改变，为难治性癫痫的临床治疗 开辟新的途径，奠定理论基础。方法：将20只SD大鼠随机 分模型组（A组）、移植组（B组），每组10只。在大脑立体 定向仪上定位大鼠大脑海马CA3区，用微量进样器缓慢注入 KA lul,制成难治性癫痫模型，然后B组经尾静脉注入 Hoeschst33342标记的骨髓基质细胞lml。取A组、B组鼠脑 做HE切片，观察细胞形态学变化。结果：模型组的病理改 变表现为海马周围卫星灶形成，腔隙层、辐状层和锥体细胞 层有神经元吞噬现象，神经元缺失，其中CA3区表现得最为 明显，齿状回苔醉状纤维出芽进行性增加。移植组较模型组 海马周围卫星灶变小，细胞间隙较移植前减小，细胞增多且 排列较整齐。结论：骨髓基质细胞具有修复癫痫病灶的能力。 关键词癫痫骨髓基质细胞诱导分化移植 doi:10. 3969/j. issn. 1007_614x. 2011. 11.005 难治性癫痫是指临床经过迁延，频繁的癲痫发作至少每 个月4次以上，应用适当的第一线抗癫痫药物正规治疗，药 物的血中浓度在有效范围内，无严重的药物不良反应，至少 观察2年仍不能控制发作，影响日常生活，同时并无进行性 中枢神经系统疾病或占位性病变者。目前常用的抗癫痫药物 在神经系统、消化系统、心血管方面的不良反应影响了其临 床应用。外科手术切除癫痫病灶的方法会对病人的远期生活 质量产生很大的影响。80年代许多学者致力于从胚胎脑中分 离出神经细胞移植入受损的脑内，使神经功能得到明显改 善，这说明神经细胞移植是治疗神经疾病的有效手段 sup】 [1，2] /sup】。研究发现，骨髓中间质干细胞（MSCs）具 有干细胞持续增殖和多向分化的特性，在一定的条件下可以 分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等 sup】 [3] /sup】，可自体移植，不存在免疫排斥反应，使其成 为细胞移植治疗理想的选择。 采用4?6周龄，体重120?160g的SD大鼠为研究对象， 将以Hoeschst33342标记的BMSCs经尾静脉注入难治性癫痫 的大鼠体内，了解细胞移植治疗对癫痫大鼠神经功能的改善 情况，从而探讨BMSCs对癫痫的修复和治疗作用，现报告如 下。 资料与方法 实验动物：细胞培养选择4?6周齡Wister大鼠，动物 模型选择6?8周齡Wister大鼠。 主要试剂：DMEM-LG培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、bFGF、 EGF、Hoeschst33342、Percoll淋巴细胞分离液、戊巴比妥、 海人酸、肝素、注射用青霉素钠、注射用链霉素。 主要仪器：细胞培养瓶、超净工作台、CO [sub] 2 L/sub] 培养箱、倒置相差显微镜（Olympus）、离心机、电子天平、 冰箱、烤箱、微量进样器、脑立体定向仪。 试剂配制：①低糖DMEM培养基的配制：DMEM培养基 10. 0g,青霉素 105IU,链霉素 105IU, NaHCOtsub] 3 [/sub] 3. 7g,加入三蒸水800ml,用稀盐酸调制pH值7.2,定溶 1000ml, 0.22 um微孔滤膜过滤。将配置的培养液进行负压 抽滤除菌，分装备用。使用前加胎牛血清（终浓度10%）。②PBS 液的配制：NaCl 8g, KCI 0. 2g, Na sub】2 /sub】HPO sub】 4 /sub】1.15g, KH sub】2 /sub】P0 sub】4 [/sub] 0. 2g,加三蒸水800ml，充分溶解后，调pH值7. 2，定溶至 1000ml。③胰蛋白酶的配制：称取0. 25g胰蛋白酶，将其溶 于100ml PBS液中，洁净工作台中抽滤分装备用。 试验方法：①大鼠骨髓基质细胞体外分离、培养：取4? 6周龄Wister大鼠，1%戊巴比妥0. 4ml/100g腹腔麻醉后拉 颈处死，置于75%酒精中浸泡5?10分钟，再用75%酒精、 3%碘酒消毒大鼠双侧下肢，在无菌条件下取大鼠双侧股骨和 腔骨，剔除骨表面附着的肌肉组织，用无菌注射器抽取DMEM 培养液，不含胎牛血清。从骨的一端冲洗骨髓腔，反复冲洗 数次，另一端收集冲洗出来的骨髓，将收获的骨髓用5号针 头注射器反复抽吸以打散组织块成为均匀的细胞悬液，然后 以1:1的比例缓慢叠加到密度1.073g/L的percoll淋巴细 胞分离液上，以2000转/分离心15分钟；收集中间乳白色 的单个核细胞层，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液调节 细胞密度2X 10 sup】5 /sup】 /ml,然后将单个核细胞接 种到25cm sup】2 /sup】的塑料培养瓶中，置于37°C 5%C0 sub】2 /s