非洲猪瘟病毒p30蛋白的表达及间接ELISA检测方法的建立-兽医专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学 校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签字： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 青岛农 青岛农业大学兽医硕士论文 摘要 非洲猪瘟病毒 p30 蛋白的表达及间接 ELISA 检测方法的建立 摘 要 非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)属于世界动物卫生组织（OIE）要求报告的动 物疫病，我国动物病原微生物名录中将其列为一类动物疫病。自上世纪初，肯尼亚发生 第一期疫情后，陆续蔓延至非洲、欧洲、美洲、亚洲，严重威胁我国的养殖业发展，为 了防止 ASF 疫情的突然爆发，进行疫病监测刻不容缓。我们有必要建立一种快捷、准确 的方法作为技术储备。 p30 蛋白是 ASFV 的重要结构蛋白，由 CP204L 基因编码，有强的免疫原决定簇， 可作为体液免疫反应中非常有效的诱导蛋白，并且在感染后的早期表达和分泌，常被用 于感染后免疫反应的早期检测，与其他 ELISA 方法相比，p30 rELISA 可以提前一周检测 到 ASFV 特异性抗体。 根据 GenBank 公布的 ASFV 基因组序列（登陆号：FR682468）中的 CP204L 基因设 计引物，扩增出非洲猪瘟病毒 p30 基因全片段，插入到 pOET-1 质粒中，构建了重组质 粒 pOET-p30，将鉴定过的重组质粒与杆状病毒 flashBAC DNA 同时转染 sf9 细胞，获得 重组杆状病毒。SDS和 Western Blot 分析显示表达的重组蛋白大小约为 30KDa， 能与 His 标签抗体和非洲猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应，该蛋白的表达为非洲猪瘟 ELISA 方法的建立提供了抗原。 以纯化的 ASFV p30 蛋白作为抗原包被 ELISA 反应板，待检血清的稀释倍数设置为 1:40，通过试验选择了重组 ASFV p30 蛋白抗原的最佳包被浓度。结果表明：重组蛋白 最佳包被浓度为 200ng/mL。本研究在国内首次建立了以真核表达的 p30 作为抗原的间接 ELISA 方法，特异性试验证实该方法能够与我国流行的 CSF、PRRS、FMD、PRV 进行 鉴别诊断。对临床 24 份阴性样品进行检测计算出该方法的临界值为 0.2，以此为判定标 准对送检的 960 份血清进行检测，结果均为阴性。同时与国外进口成品试剂盒比对，发 现敏感性高于 ID-vet 公司和 SVANOVA 公司生产的间接 ELISA 试剂盒。该方法的建立 为我国 ASFV 的流行病学调查提供了一种有效的抗体检测方法，可早期发现 ASFV 抗体。 关键词：ASFV；p30；真核表达；间接 ELISA 青岛农 青岛农业大学硕士专业论文 Abstract Expression of p30 Protein of African Swine Fever Virus and Establishment of Indirect ELISA Abstract African swine fever is the animal disease that should be reported to the world organization for animal health (OIE) and is classified as the 1st animal disease in China. Since the last century,it first occurred in Kenya, and then spread to Africa, Europe, America and Asia, which is a great risk to the pig-industry in our country. In order to prevent the outbreak of ASF, disease monitoring is urgently needed and it is necessary to establish a