肺癌免疫酶组化检测试剂盒的研制-微生物与生化药学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 重庆理 重庆理工大学硕士学位论文 I万方数据 I 万方数据 PAGE IV PAGE IV 万方数据 肺癌免疫酶组化检测试剂盒的研制 摘要 肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，近年来在我国和其他国家肺癌的发病 率和死亡率已经上升为恶性肿瘤的第一位，由于大气污染加重等因素，肺癌的发病率 和死亡率均呈明显上升的趋势。由于肺癌诊断技术的不完善，许多肺癌患者在就诊时 已经失去了最佳的治疗时间，因此肺癌的诊断显得尤为重要。 目前，临床常用的H.E染色法难以完全准确地判断出肿瘤的性质，而免疫组织化 学不仅能准确地诊断出肿瘤的性质，还可以预测肿瘤预后的生物学行为。其次，免疫 组织化学技术还可以指导某些肿瘤的化疗，其在确定组织起源的应用前景是无限的。 所以，研制肺癌的免疫组织化学诊断试剂药盒，在肺癌的早期确诊、预防和治疗等方 面具有重要价值和实际应用意义。 本课题采用BALB/c小鼠体内生产单抗的方法制备肺癌单克隆抗体，采用辛酸-硫 酸铵法纯化肺癌单抗，纯化后的单抗浓度为3.0426mg/ml，纯度为80%-90%，已达到 电泳纯。采用免疫组化法鉴定肺癌单抗的特异性，结果显示肺癌单抗是针对大细胞肺 癌的特异性抗体；采用免疫印迹法对大细胞肺癌相关蛋白进行鉴定，结果显示肺癌单 抗针对大细胞肺癌的蛋白为NCIH460细胞质内约90KD的蛋白质。 用纯化后的肺癌单抗对新西兰大白兔进行长程免疫，四次免疫后检测效价可达到 1：1024000以上，采用颈动脉采血后用辛酸-硫酸铵法纯化兔血清，纯化后兔血清IgG 的浓度为28.5468mg/ml，纯度为80%-90%，已达到电泳纯；采用过碘酸钠氧化法酶标 记纯化后的兔抗肺癌单抗抗体，用直接ELISA法测定其效价和特异性：酶标后的效价 可达到1：32000以上，酶标抗体作为试剂盒的第二抗体；酶标兔抗肺癌单抗的抗体中 HRP浓度为1.584 mg/ml， IgG浓度为2.5056mg/ml ，HRP/IgG比约为1.60，酶结合率 为31.68%，达到酶标二抗理化性质的标准。 建立肺癌免疫组化检测试剂盒，试剂盒中过氧化物酶祛除剂反应的最佳浓度和反 应时间为3％过氧化氢/甲醇室温静置10 min；封闭液的最佳反应温度和时间为37℃温 育20 min；一抗反应的有效范围为1：50-1：500，稀释度为1：100，最佳反应温度和 时间为37℃温育1h，用量为100ul；二抗反应的有效范围为1：50-1：800，稀释度为1： 200，用量为100ul，最佳反应温度和时间为37℃温育30min；选用的DAB染色剂时间 应该控制在30-50s之间，复染时选用的苏木素时间应该控制在15-30s之间，最佳用量 为覆盖住切片中的病理组织即可。 关键词：免疫酶技术；肺癌； 诊断 ；免疫组化；癌症 Immunoenzymatic Tissue Chemistic Kit for Lung Cancer Abstract Lung cancer is one of the most common malignant tumor in the world.In the resent years lung cancer’s incidence and mortality have risen for the first.For such factors as air pollution increasing,lung cancer’s incidence and mortality display a clear upward trend. Because of the imperfections of lung cancer diagnosis, many lung cancer suffers in clinic had already lost the best treatment time, so the diagnosis of lung cancer is especially important. At present H.E staining could commonly be used in clinical, but it could not be used to accurately diagnose the nature of the tumor. While immunohistochemistry can not only be used to accurately diagnose the nature of the tumor, but also can predict the biological behavior of tumor prognosis. In other areas, i