葛根素对鱼藤酮诱导帕金森模型的保护作用及其机制-神经内科专业论文.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE PAGE 1 英文缩写 英文缩略词 英文全称 中文全称 APO apomorphine 阿朴吗啡 DA dopamine 多巴胺 LB MPP+ Lewy body 1-methyl-4-phenylpyridinium 路易小体 1-甲基-4-苯基吡啶离子 MPTP 1-methyl-4-phenyl-1, 2，3, 6- 1-甲基-4-苯基-1, 2, 3,6-四氢吡啶 PD Parkinson’s disease 帕金森病 ROS reactive oxygen species 活性氧 SNc Substantia nigra pars compacta 黑质致密部 TH tyrosine hydroxylase 酪氨酸羟化酶 VTA ventral tegmental area 腹侧被盖区 6-OHDA 6-hydroxydopamine 6-羟基多巴 DAT dopamine transporter 多巴胺转运体 VMAT 2 vesicular monoamine transporter 2 囊泡单胺转运体 2 MTT 3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl) 噻唑蓝 Ub Ubiquitin 泛素 FCM Flow cytometry 流式细胞术 ROS reactive oxygen species 活性氧 Rot Rotenone 鱼藤酮 PUR puerarin 葛根素 DA Dopamine 多巴胺 葛根素对鱼藤酮诱导帕金森模型的保护作用及其机制 华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科 学生姓名：张晓薇 导 师：王涛 教授 中文摘要 1.目的 帕金森病是一种中老年人常见的神经系统变性疾病，以多巴胺能神经元进行 性丢失为病理特征。氧化应激作为在帕金森病重要的发病机制之一，会造成多巴胺能 神经元受损死亡。葛根素为中药葛根中提取的一种活性成分，具有抗氧化及抑制神经 细胞凋亡的作用，是否可用于保护多巴胺能神经元值得探索。因此，本实验旨在观察 葛根素对神经元的保护性作用及其机制，从而为帕金森病的修饰和保护治疗提供依 据。 2.方法 ㈠ 细胞模型：鱼藤酮（Rot, Rotenone）诱导 SH-SY5Y 细胞的 PD 模型。 ① MTT（噻唑蓝）比色法：实验分组为空白对照组，鱼藤酮（Rot）模型组和不同浓 度的葛根素（PUR，Puerarin）药物处理组（10μM，50μM，100μM，150μM 浓度组）。 葛根素预处理 24 小时后，鱼藤酮再处理 24 小时。MTT 法检测细胞存活率。 ② 分组同上，DCFH-DA 按照试剂盒实验步骤进行细胞荧光染色，分别采用流式细胞 仪检测（FCM，flow cytometry）和普通荧光显微镜观察细胞内 ROS ③ 分组同上，Annexin V-FITC 试剂盒进行细胞凋亡检测。 ㈡ 动物模型： ① 采用立体定向仪（stereotaxic apparatus）注射鱼藤酮（6μg/μl）于 Sprague–Dawley （SD）大鼠右侧黑质致密部（substantia nigra compact part，SNc）和腹侧被盖区 （ventral tegmental area，VTA），分为四个处理组：空白对照组（DMSO），Rot 组， (Rot +PUR 50μM)组，(Rot +PUR 100μM)组,其中葛根素处理组于第三天 APO 旋转 实验评定后，连续注射 7 天。 ② 分四周给予 SD 大鼠皮下注射阿朴吗啡（apomorphine，APO）诱导旋转。 ③ 处死大鼠后，免疫荧光染色观察黑质区酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）， 多巴胺转运体(dopamine transporter, DAT), 囊泡单胺转运体 2(vesicular monoamine transporter 2,VMAT2) 以及泛素（Ubiquitin，Ub）免疫活性变化。 3.结果 ㈠ 细胞模型： 与单用鱼藤酮的模型组相比，（Rot+PUR）处理组（PUR 10μM，100μM，150μM） 细胞存活率有显著升高（P0.05），（ROT+PUR 10μM，50μM）组的 ROS （reactive oxygen species）水平下降（P0.05），（ROT+PUR 10μM）组凋亡率下降（P0.05）。 ㈡ 动物模型： ① APO 旋转行为学：与立体定向注射鱼藤酮后的模型组大鼠相比，鱼藤酮造模后给 予腹腔注射葛根素（50μM，100μM）组的大鼠旋转圈数在第一周和第二周评定时有 明显减少（P0.05）。 ② 免疫荧光：与单用鱼藤酮组相比，大鼠黑质中（