钙网织蛋白促进类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞存活和新生血管形成的分子机制研究-临床医学专业论文.docx

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 不保密 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医科大学博士学位论文 天津医科大学博士学位论文 目的： 中文摘要 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是免疫介导的以慢性、侵袭性外周 关节炎为主要临床表现的疾病。RA 的主要病理特征是关节滑膜炎和侵蚀性血管 翳的形成，最终导致关节骨质破坏及关节功能障碍。RA 的病因和发病机制目前 尚未完全阐明。有研究报道，钙网织蛋白（Calreticulin,CRT）可能参与了 RA 的发病机制。本课题组前期的研究结果表明，CRT 在 RA 患者体内表达升高， 且血清 CRT 水平与 RA 患者疾病活动度呈显著正相关。此外，既往研究和我们 前期工作还显示 CRT 可能通过抑制 T 细胞凋亡参与 RA 的发病。本课题在以往 研究的基础上，进一步探讨 CRT 通过促进 RA 成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）存活和新生血管形成参与 RA 滑膜炎症的发病机制, 为揭示 RA 的发病机制和寻找新的治疗靶点奠定实验基础。 方法： 1. 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 106 例 RA 患者、75 例骨性关节炎 （osteoarthritis，OA）患者及 80 例健康对照（healthy control，HC）血清中钙网 织蛋白（CRT）的含量，同时检测 25 例 RA 和 22 例 OA 患者关节滑膜液中 CRT 的含量。 2. 采用免疫组织化学技术检测 RA 和 OA 患者滑膜组织中 CRT 以及抗凋亡分子 Bcl-XL 和 Mcl-1 的表达，并进一步分析 RA 滑膜组织中 CRT 表达水平与 Bcl-XL 和 Mcl-1 表达水平之间的相关性。 3. 采用胶原酶消化法分离 RA 和 OA 患者滑膜组织中的成纤维样滑膜细胞（FLS） 并进行体外培养。应用实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、 Western Blot 以及细胞免疫荧光等技术，检测 RA 和 OA FLS 中 Bcl-XL 和 Mcl-1 的表达。 RA 和 OA FLS 体外分离培养，加入不同浓度的人重组 CRT，qRT-PCR 和 Western Blot 分别检测 FLS 中 Bcl-XL 和 Mcl-1 的表达。 评估 PI3K/Akt 和 STAT3 信号通路在 CRT 介导 RA FLS 中的 Bcl-XL 和 Mcl-1 表达上调中的作用。RA FLS 体外培养，PI3K/Akt 或 STAT3 信号通路抑制剂预 孵育，然后加入人重组 CRT，qRT-PCR 和 Western Blot 检测 Bcl-XL 和 Mcl-1 的 表达。Western Blot 分析 CRT 刺激下 PI3K/Akt 和 STAT3 通路的主要信号分子在 I RA FLS 中的激活和表达。 6. 采用 MTT 试验检测 CRT 对 RA FLS 增殖的影响；流式细胞术凋亡细胞染色 检测 CRT 对 FasL 诱导的 RA FLS 凋亡的影响。 7. 采集新生儿的脐带标本，胶原酶脐带灌注消化法分离人脐静脉内皮细胞 （HUVECs）并体外培养。加入人重组 CRT，检测 HUVECs 产生 NO 的量，qRT-PCR 和 Western Blot 检测 CRT 刺激下 HUVECs 中 PI3K/Akt-eNOS 的激活和表达。 8. 分别采用 MTT 试验、细胞划痕试验以及构建体外血管生成的三维模型检测 PI3K/Akt-eNOS-NO 信号通路在 CRT 介导的 HUVECs 增殖、迁移及管腔形成中 的作用。 结果： 1. RA 患者血清中 CRT 含量 [(6.4±3.1) ng/ml]显著高于 OA 患者[(3.7±0.9) ng/ml] 及 HC[(3.