高产谷胱甘肽工程菌的构建及代谢产物研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

曲阜师范大学 2011 级硕士毕业论文 I 万方数据 摘要 还原型谷胱甘肽(GSH)是一种由 L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成三肽化合物，在 生物体内广泛存在且具有清除自由基、抗氧化、解毒、抑制 HIV 等功能。因此 GSH 被广 泛的应用于临床医药、食品加工、化妆品等行业。目前，工业上可以利用发酵或酶合成的 方法生产 GSH，由于我国还没有实现 GSH 的大规模生产，其主要依赖于外国进口。因此， 实现我国 GSH 的工业化生产迫在眉睫。 微生物发酵法是生产GSH的最主要的方法。在大多数真核细胞和革兰氏阴性细菌中， 谷胱甘肽的生物合成主要是通过两步依赖于ATP的酶催化反应。L-谷氨酸、L-半胱氨酸在γ- 谷氨酰半胱氨酸合酶（GSH I）的作用下合成γ-谷氨酰半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合酶(GSH II）的作用下，与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。在谷胱甘肽的生产过程中，GSH I受到GSH的 反馈抑制。最近的一些研究表明，在一些致病性的革兰氏阳性细菌中存在一种双功能酶—γ- 谷氨酰半胱氨酸合酶-谷胱甘肽合酶（GshF），该酶可以单独催化谷胱甘肽的生成，且对 反馈抑制不敏感。本文旨在于利用生物合成的方法获得整合异源GshF基因的高产GSH酵母 菌株，再通过培养条件的优化，提高GSH的产量。具体研究内容如下： （1）高产GSH酿酒酵母菌的构建 将克隆的 GshF 基因分别与含有不同启动子（GAP-SCP、GAP-PC、PGK1、GAL1）的 载体连接形成融合基因，获得含有不同启动子的表达载体，将表达载体转化酿酒酵母 W303-1B 。通过 G418 抗性筛选标记筛选获得阳性克 隆 w303B/GshF-GAP-SCP 、 w303B/GshF-GAP-PC、w303B/GshF-PGK1、w303B/GshF-GAL1，然后利用 ABD-F 柱前衍 生法进行代谢产物 GSH 的分析。结果表明，通过摇瓶培养，w303B/GshF-GAP-SCP 为高产 GSH 酿酒酵母工程菌。 （2）高产 GSH 酿酒酵母工程菌 w303B/GshF-GAP-SCP 的最适培养条件优化 在摇瓶水平上通过单因素实验，考察培养时间、培养基中葡萄糖含量对 GSH 产量的 影响。得到最佳发酵条件：发酵温度 30℃，摇床转速 200 rpm，接种量 OD600=0.15，葡萄 糖含量为 20 g/L，培养时间为 3 d。GSH 产量可达到 150 mg/L。 （3）氨基酸前体添加对工程菌生产 GSH 的影响 在摇瓶水平上考察三种前体氨基酸的添加对 GSH 产量的影响。结果表明，氨基酸前 体的添加可以显著提高工程菌胞内 GSH 的产量，w303B/GshF-GAP-SCP 合成 GSH 的最高 产量可达 250 mg/L。 （4）外泌蛋白（Adp）在高产谷胱甘肽酿酒酵母中的整合表达 本实验构建了酵母自身的外泌蛋白基因 Adp 同源整合表达载体，转化酵母获得工程菌 株 w303B/GshF-GAP-SCP/Adp，在摇瓶水平上考察 Adp 对工程菌 GSH 产量的影响。结果 表明，Adp 的整合能够影响菌体生物量，但具有一定的外泌功能。 （5）工程菌 w303B/GshF-GAP-SCP 的 10 L 发酵罐放大培养 工程菌 w303B/GshF-GAP-SCP 9#以 10%的接种量接种于装液量为 4 L YPD 培养基的 II 万方数据 10 L 发酵罐中，进行发酵罐的放大培养，结果表明工程菌的谷胱甘肽合成能力升高。 关键词：还原型谷胱甘肽；双功能谷胱甘肽合酶；依赖 ATP 透过酶 Adp1；发 酵优化；放大培养  PAGE 6 万方数据 Abstract Glutathione (GSH) is a tripeptide composed of the amino acid residues L-cysteine, L-glutamic acid and glycine. It is one of the main nonprotein antioxidants presenting in living organisms and is predominantly found in eukaryotic cells. It plays a vital role in many physiological functions and has a number of diverse applications in food, pharmaceutical, and cosmic industries. GSH could be industrially produced by fermentation or enzymatic synthesis. How