高迁移率族蛋白B1影响前列腺癌冷冻免疫反应的实验研究-临床医学;肿瘤学专业论文.docxVIP

犬津医科人学硕士学位论文中文摘要 犬津医科人学硕士学位论文 中文摘要 目的 观察体外激素难治性前列腺癌细胞系冷冻消融后高迁移族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGBl)表达的规律，及其与体外诱导异体外周血来 源的树突状细胞(dendritic cell，DC)分化成熟的关系，初步探讨HMGBl对冷 冻免疫反应的影响。 材料和方法 培养激素难治性前列腺癌细胞系PC．3，经冷冻消融(利用Endocare公司氟 氦冷冻系统直径1．7mm冷冻器)裂解细胞后收集上清液，藉酶联免疫吸附试验 (ELISA)方法对冷冻前后上清液中的HMGBl进行定量分析。然后应用western blot检测不同数量PC．3细胞冷冻坏死上清液中HMGBl的释放情况。采集前列 腺癌患者抗凝的新鲜外周血，应用淋巴细胞分离液(Ficoll)用贴肇的方法分离单 个核细胞(PBMC)，经重组人粒细胞．巨嗾细胞集落刺激冈子(rhGM．CSF)、重组 人白细胞介素4(rhlL．4)，体外诱导培养获取未成熟DC(imDC)。将PC．3细胞冷 冻坏死上清液直接或加入足量HMHBl中和抗体分别与imDC混合，在体外适宜 培养条件下进行培养。倒置显微镜下观察细胞形态，进一步在共聚焦显微镜下 观察DC骨架结构变化。流式细胞仪测定DC表面成熟共刺激分子分子CD83、 CD86、HLA-DR的表达。观察HMGBI刺激与DC表面成熟共刺激分子CD83、 CD86和HLA-DR表达的时．效关系及量．效关系。 结果 1．流式细胞术分析，冷冻消融前PC．3细胞正常、凋亡、坏死三种状态的 比例分别为(95．584-1．23)％、(2．00-M．61)％、(O．565：1．09)％，冷冻消融后PC．3 正常、凋亡、坏死三种状态的比例分别为(12．22+9．53)％、(5．46+1．14)％、 (82．70-a：l 1．35)％，两者比较差异具有统计学意义(P0．05)。 2．ELISA结果显示：1X106／na组、1×10‘7／ml组、l×108／ml组PC．3细胞上 清液中HMGBl浓度分别由冷冻前的(4．591-0．25)ng／ml、(6．04：L-0．13)ng／ml、 (7．39-1-0．18)ng／ml上升至(14．28i-0．84)ng／ml、(71．68+4．62)ng／na、(329．64+32．89) ng／ml，差异具有统计学意义(P0．01)。western blot同样证实：随着PC．3细胞 数量增加，冷冻坏死一lz清液中的HMGBl浓度也随之增加。 细胞体积增 细胞体积增 度增加。冷 细胞膜周围 4．冷冻坏死上清液中的HMGBl诱导DC表面成熟共刺激分子高表达：冷 冻刺激组，DC表面成熟共刺激分子CD83、CD86、HLA．DR表达较对照组上调 明显(PO．01)；抗体干预组，DC表面成熟共刺激分子CD83、CD86、HLA．DR 表达较冷冻刺激组明显下降(尸O．01)，但较对照组仍高(P0．05)。 5．冷冻坏死上清液中的HMGBl诱导DC表面成熟共刺激分子表达的时． 效关系：用浓度为lxl06／ml的PC．3细胞冷冻坏坏死上清液分别与iDC共培养 24h、48h和72h，DC表面成熟共刺激分子CD83、CD86和HLA．DR表达分别 于24-72 h明显上调(PO．05，P0．01)，其中以培养48 h组DC表面共刺 激分子表达上调最为显著俨O．01)。 6．冷冻坏死上清液中的HMGBl诱导De表面成熟共刺激分了表达的量． 效关系：与空白对照组相比，lxl06／ml、lxl07／Inl组DC表面共刺激分子CD83、 CD86、HLA．DR明显上调(PO．05，P0．01)，lxl08／ml组DC表面仅CD83 表达明显卜调(PO．05)，CD86、HLA．DR无明显变化(PO．05)。 结论 冷冻消融导致肿瘤细胞坏死，坏死肿瘤细胞释放HMGBl作为一种内源性 危险信号，可使DC细胞骨架发生变化，增强其游走迁移能力，促使免疫突触形 成，方便其进入淋巴结，与T细胞作用引发免疫反应，从而启动特异性T细胞 免疫应答。同时，HMGBl在冷冻免疫反应中具有双重调节作用，低浓度的 HMGBl可作为重要的免疫刺激信号，促进DC表面成熟共刺激分子高表达，并 在一定时间内达到作用强度峰值；高浓度的HMGBl则使DC表面成熟共刺激分 子表达受到抑制，对DC免疫功能活化起到一定的抑制作用。 关键词：前列腺癌冷冻消融高迁移族蛋白B．1树突状细胞免疫反应 U 犬津医科人学硕士学位论文Abstract 犬津医科人学硕士学位论文 Abstract objective： To investigate the consequences of HGMB 1(hi