downs综合征关键新基因的克隆与表达分析.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘要 Down’S综合征即人类2l号染色体三体综合征，是新生儿中最常 见的染色体异常，其发生率约1／700。克隆与分离21号染色体上的基 因是阐明Down’S综合征以及其他定位在21号染色体上的单基因遗 传病的关键步骤。为了寻找新的Down’S综合征的相关基因，我们在 Down’S综合征关键区(21q22．2—22．3)筛选2个在胎脑中有表达 的EST进行全长cDNA的克隆，并对其表达特征进行分析。 第一部分Down，s综合征关键区一个假基因的克隆与表达分析 从EST HH504一F出发，采用RACE的方法在成人脑及心脏 eDNA文库中分离与克隆到一个新基因，命名为NYl，Genebank的 接受号为AF511647。该基因全长cDNA2964bp，定位在21q22．2 Down’S综合征关键区内，含有三个Alu重复序列，无内含子及完整的 开放阅读框(ORF)，在3 7端有类似于Poly A尾的结构，因而符合 返座假基因的特点。R卜PcR与Northem杂交分析结果显示，这一 基因在多种组织中有表达，但呈现出表达差异及组织特异性。 第二部分人PKNOXl基因全长eDNA的克隆与表达分析 利用5’RACE与3’RACE方法，克隆到PKNOXl基因新的eDNA 序列约1．7kb，其中在5’端克隆到不参与编码的第--#b显子eDNA序 列。将新克隆到的cDNA序列与公布的PKNOXl基因eDNA序列进 行拼接，得到PKNOXI基因的全长eDNA序列495lbp，这一序列成 功地登录在Genbank中，接受号：AYl96965。Northern blot结果显示， 在胎儿组织中，PKNOXl的转录本约5kb大小，此外还存在一个表达 量较低约2．9kb大小的转录本。RT--PCR以及mRNA原位杂交分析 结果显示PKNOX，基因在所有被检测的组织中表达。通过半定量PCR 的方法，比较正常胎儿组织与Down’S综合征胎脑组织PKNOXl基因 IV  呈现过度表达。因此，PKNOXl基因可能是Down’s综合征相关基因 的侯选基因。生物信息学分析显示，PKNOX，编码436氨基酸的蛋白 质，PI为4．79，分子量47．6KD，257位氨基酸至320位氨基酸为保 守的同源盒结构域。采用自身优化预测法(self-optimized prediction． SOPM)对PKNOXl基因所编码蛋白质的二级结构进行预测，发现 32．57％的氨基酸组成Q。螺旋结构，16．28％氨基酸组成延伸主链， 44．04％的氨???酸组成无规则卷曲，7．11％的氨基酸组成8．转角。此外， PKNOX，基因还存在多个苏氨酸、丝氨酸与酪氨酸磷酸化位点。 第三部分人PKNOXl基因两种选择性剪接型eDNA的克隆及 表达分析 采用相同的技术路线，我们从人类睾丸组织cDNA文库中克隆到 PKNOX．基因的两种选择性剪接型的全长cDNA，分别命名为 PKNOX-B、PKNOXIC。 选择性剪接型PKNOXlB的全长cDNA 2793bp(Genbank接受号 为AYl42115)，编码405个氨基酸碱基的酸性蛋白质，分子量为 44．628kda，等电点6．28。生物信息学分析结果显示，PKNOXlB基因 跨越58．4kb，有11个外显子和10个内含子。 与PKNOXl进行比较，PKNOXlB与PKNOXl的前9个外显子及 8个内含子完全相同，由于PKNOXlB在第10与ll外显子之间发生 了差异剪接，以致其在3’端被截短约2kb，所编码的蛋白质在c端较 PKNOX。短了31个氨基酸碱基，但PKNOXl保留了与PKNOXl完全 相同的同源盒结构域，因而它可能与其它含同源结构盒结构域基因家 族成员一样参与了发育的遗传调控。R]’__PCR结果显示PKNOXlB 在人体组织中广泛表达。在睾丸组织中PKNOXlB可见5kb，2．9kb， 2kb三种转录本，而其它组织中仅发现两个较大的转录本，2kb的转 录本在睾丸组织中呈现特异性的表达。采用半定量PCR的方法比较 Down，S综合征胎儿组织与正常胎儿组织PKNOXlB基因的表达水平， 发现Down’s综合征胎脑组织中PKNOXIB基因的表达水平较正常高，  提示PKNOXlB基因的过度表达有可能参与Down’S综合征的某些表 型的形成，是Down’s综合征相关基因的侯选基因。利用生物信息学 方法对KNOX，B基因所编码蛋白质的二级结构以及翻译后蛋白质的 磷酸化修饰位点进行了预测，与PKNOXl一样，PKNOX，B也存在多 个苏氨酸、丝氨酸以及酪氨酸磷酸化位点，推测磷酸化过程参与了该 基因功能的调控。但PKNOX。B的实际功能必须通过进～步实验进行 了解与验证。 人类KNOX，基因另一种选择性剪接型