dixdc1对结直肠癌发展的影响机制以与其相关microrna的分析.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 复旦大学上海医学院博士学位论文 中文摘要 DIXDC 1对结直肠癌发展的影响机制以及与其 相关microRNA的研究 中文摘要 前言 DIXDCl是新近克隆的人类Wnt通路的新基因，即ccdl基因 (Coiled．coil．DIXl)人类的异构体，ccdl基因在斑马鱼神经管发育过程中被证实 是一个Wnt通路的正调控因子。25％左右的人微卫星不稳定性(microsatellite instability)MSI．H的结直肠癌中检测到Wnt通路重要组分Axin2基因突变。上述 突变集中于外显子7上的4个单核苷酸连续序列，导致移码和Axin2蛋白C．末 端(包括DIX结构域)的缺失，提示Axin2蛋白的C一末端可能参与抑制结直肠癌 的发生和发展，然而机制不甚清楚。DIXDCl蛋白就是以Axin2的C．末端为诱 饵，通过酵母双杂交实验，筛选出的与Axin2 C．末端存在相互作用的一个蛋白。 目前DIXDCl基因全长已经成功地被克隆并制各了相应的抗体，但关于 DIXDCl生物化学及细胞生物学的研究报道较少。有研究显示DIXDCl属于actin 和tubulin结合蛋白家族的新成员，提示其可能参与对细胞形态和运动的调节。 DIXDCl作为Wnt通路的新成员分子，其具体功能怎样，如何通过Wnt通 路对于结直肠癌的发生、发展进行调节；其本身是否受到Wnt通路的调节，其 调节方式如何；microRNA是否也参与调控DIXDCl的表达，与其相关的miRNA 与结直肠癌的发生发展关系如何，目前未见国内外报道。本课题从研究DIXDCl 的功能为切入点，将首次阐明其在结直肠癌发生发展过程中的生物学作用及机 制；并进一步探讨Wnt通路对DIXDCl蛋白表达水平的影响及机制；利用miRNA 芯片及生物信息数据库筛选出与DIXDCl存在相互作用的miRNA，进一步验证 相关miRNA对DIXDC 1表达的调控并探讨相关miRNA对结直肠癌发生发展的 影响。为结直肠癌发生发展机制研究提供新的实验依据，为临床结直肠癌的诊断 和治疗提供一定的理论基础。 第一部分DIXDCI对大肠癌细胞生物学特性的影响及机制研究 目的 阐明DIXDCl对大肠癌细胞生物学特性的影响并进一步深入研究其机制。  复旦大学上海医学院博士学位论文 中文摘要 方???脂质体介导的稳定转染方法建立DIXDCl过表达的DLDl细胞；MTT法 和裸鼠成瘤实验检测细胞增殖能力；免疫组织化学方法检测DIXDC 1在结直肠 癌组织中的表达情况及其与增殖指数Ⅸi．67)的相关性；流式细胞仪检测细胞周期 分布和凋亡情况；Western blot检测细胞周期相关蛋白表达水平和P13K、MAPK 信号通路激活状态；双荧光素酶报告系统检测DIXDCl对TCF／LEF转录活性的 影响；免疫共沉淀技术验证DIXDC 1与Phospho．AKT之间的相互作用；采用P13K 信号通路抑制剂LY294002处理，观察其对DIXDCl过表达细胞生长情况、细胞 周期及周期相关蛋白表达的影响；转染DIXDCl siRNA干扰DIXDCl表达后， 观察其对DIXDC l过表达细胞生长情况、细胞周期及周期相关蛋白表达和P13K 信号通路的影响。 结果DIXDCl的过表达于体外水平促进大肠癌细胞的增殖，于体内水平促进裸 鼠移植瘤形成及生长。与正常肠粘膜相比，结直肠癌组织中DIXDCl蛋白表达 水平升高，并且与增殖指数Ki．67的表达具有密切的相关性。DIXDCl通过上调 cyclin D1、下调p21蛋白表达进而促进细胞周期G0／G1到S期的转化，且激活 P13K信号通路。同时DIXDCl可以上调fl-catenin蛋白表达，并且具有增强 TCF／LEF转录活性的作用。通过P13K信号通路抑制剂作用或者干扰DIXDC 1蛋 白的表达后，13-catenin和cyclin D1蛋白表达下调而p21蛋白表达升高，同时阻 滞了细胞周期G0／G1到S期的转化。 结论DIXDC 1具有促进大肠癌细胞增殖和肿瘤形成的作用，其过表达后可以通 过上调cyclin D1和下调p21蛋白表达进而促进细胞周期G0／G1到S期的转化， DIXDC 1促大肠癌细胞增殖效应可能与P13K信号通路的激活相关。 第二部分Writ通路对DIXIOCl的调控及其机制研究 目的阐明Wnt通路对DIXDCl蛋白表达的调控及其相关机制。 方法免疫组织化学方法检测DIXDCl与13-catenin在结