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miR-125b通过负调控NF-r,B信号通路抑制PRRSV增殖摘要 miR-125b通过负调控NF-r,B信号通路抑制PRRSV增殖 摘要 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又 名“蓝耳病”至1987年首次报道于美国以来，现已遍及全球大部分养猪地区和国家， 给养猪业造成了巨大的危害和重大的经济损失，猪繁殖与呼吸综合征病毒是该病的 主要病原。该病毒包含九个开放性阅读框和两端的非编码区，自然感染主要在猪肺 泡巨噬细胞中，人工感染也只能在PAM、Mare．145和CL2621等少数几种细胞。近 年研究发现miRNA广泛参与病毒感染宿主细胞的调控过程，但在miRNA调控 PRRSV增殖研究方面，还没有相关报道。本研究通过参阅大量文献，筛选出已报道 的参与免疫调节或直接调控病毒的复制的miRNA，探讨细胞中是否存在与PRRSV 复制相关的miRNA以及miRNA在PRRSV增殖过程中的调节作用，为进一步研究 PRRSV在细胞中复制的分子生物学机制以及致病相关的生物学原理奠定基础。基于 此，本研究主要探讨以下几个方面的内容： I．影响PRRSV增殖的miRNA的确定以及其在Marc．145中的作用 参考大量文献，筛选到10条广泛参与免疫调节或影响病毒增殖的miRNA，利 用吉玛公司合成成熟序列，小分子转染后，通过绝对定量和空斑实验研究发现： miR-125b．5p具有在Marc．145和PAM抑制PRRSV增殖的活性。同时间接免疫荧光 检测N蛋白以及Western blot检测Nsp2的表达的剂量实验都证实miRNA的抗病毒 活性。 2．筛选miR-125b作用的相关基因位点以及与NF-KB的关系 通过多种miRNA靶基因预测软件以及构建相应的荧光素酶报告系统发现， miR-125b不作用于PRRSV 3UTR，同时也不作用于基因的所有编码区。宿主方面， 预测到大部分作用位点，其中包括r．B．RAS2，TNFa，SATA3等。本实验主要考虑 NF．rB信号通路，通过miR-125b与NF．r,B．1uc的共转染实验证实miR．125b通过作 用于r．B．RAS2的3’UTR稳定其mRNA水平抑制NF．r．B转录。 3．NF．!d3表达与PRRSV的增殖的关系 实验主要采用NF．KB转录的抑制剂BAYll．7082处理细胞，噬斑检测结果发现 BAYll-7082处理抑制PRRSV增殖。同时设计瞬时转染miR．125b和p65，发现超标 达p65能够逆转miRNA对病毒增殖抑制作用。研究证实NF．KB的表达有利于PRRSV 的增殖。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征；miRNA；NF．r,B； 华中农业大学2011届硕士学位论文Abstract 华中农业大学2011届硕士学位论文 Abstract Porcine reproductive and respiratory syndrome also known as”blue eat”disease has brought great harm and heavy economic losses since first reported in 1 987、析m the United States and has known in the important pig breeding Conutry．Porcine reproductive and respiratory syndrome virus is main pathogen of this disease．The virus contain nine openning coding areas and the nocoding areas on the end of the genes，natural infection mainly in pig alveolar macrophage，what。S more，artifical infection aslo in few of cells，such as PAM，Marc-145，CL2621 et a1．In recent years，the studies found that miRNA widely participated in the progress of virus infected cells，but the regulation to PRRSV proliferation by miRNA still had no report related．Ten miRNAs have been selected through refer to a large number of