基因化疗药物时序释放体系的构建及抑瘤研究-生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 不保密 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 研究背景： 恶性肿瘤已成为威胁人类健康的第二号杀手。化疗是肿瘤术后治疗的重要 辅助方案，但传统化疗药物缺乏肿瘤选择性，对肿瘤病人的正常细胞也具有很 强的毒副作用，并且长期使用会导致化疗耐药性，严重影响了化疗的治疗效果。 基因治疗协同化疗可有效增强药效，进一步研究发现，基因治疗联合化疗中， 基因与化疗药物的施药顺序、用药间隔对肿瘤抑制效果有极大的影响。对于 MDA-MB-231 乳腺癌细胞，最大的抑制率出现在先施用 miR-21 抑制剂 4 小时后 再施用阿霉素，而同时施药或先施用阿霉素却表现出拮抗作用，联合用药对肿 瘤细胞的抑制率反而低于单独用药。这一研究结果表明，基因治疗联合化疗必 须重视用药时间和用药序列问题，即联合治疗的时序问题，这就对药物载体提 出了更高的要求：一要实现基因/化疗药物同载，使得基因与化疗药物投递到同 一肿瘤细胞中发挥药效；二要控制基因与化疗药物的时序性释放，实现时序性 联合治疗，而目前研究中的载体并不能满足时序性的要求。本课题构建了以金 纳米空心球为基础的时序控制释放体系，应用其等离子共振对近红外光强吸收 的特点，实现了 miRNA 和化疗药物 DOX 的精确释放，并通过体内及体外实验 验证其肿瘤抑制效果，为临床应用提供理论依据。 研究方法： （一）材料的制备及表征 1）以银离子为模板进行置换反应制备金纳米球载体 HGPAD； 2）用树形大分子 PAMAM 修饰金纳米球得到 HGNPs，实现与 microRNA 的连 接通路； 3）采用静电吸附的方法实现 HGNPs 对化疗药物盐酸阿霉素的共载得到 HGPAD； 4）通过 MDA-MB-231 细胞验证在 as-miR-21 和 DOX 不同时序处理下的细胞抑 制率； 5）制备好样品后用透射电镜、紫外光吸收等方法对纳米材料进行表征； （二）细胞水平验证纳米材料对肿瘤细胞的杀死作用及其机制 1）以 IC50、MTT 实验来验证基因与药物时序治疗相对于游离药物对肿瘤细胞的 半数抑制浓度的变化； I 2）提取 DNA 和 RNA，用荧光定量 PCR 技术在基因水平验证 miRNA 对肿瘤细 胞的抑制作用； 3）以免疫荧光实验和 western blot 实验验证纳米材料对肿瘤抑制作用的机制； （三）采用裸鼠皮下瘤模型验证纳米药物对肿瘤的抑制作用 1）给 4-6 周龄的裸鼠皮下接种肿瘤细胞，建立小鼠荷瘤模型； 2）周期性给成瘤模型的裸鼠尾静脉注射纳米药物，并用红外光照射刺激纳米药 物实现时序释放； 3）定期量取肿瘤体积和小鼠体重，对纳米药物的抑制作用进行评估； 4）用小动物成像技术定位纳米材料在小鼠体内的分布，确定其肿瘤靶向性； 5）处死小鼠后取主要的脏器及肿瘤组织进行 HE 染色，观察纳米药物的生物毒 性； 结果： 1）通过银离子置换反应制备近红外光响应的金纳米空心球，用树形分子基因载 体 PAMAM 修饰金纳米球得到 HGPA，粒径 86nm，性质稳定，可与化疗药物阿 霉素通过正负电荷吸附作用结合得到 HGPAD，模拟体内环境下可稳定释放 as-miR-21，并响应近红外光激发实现阿霉素控释，达到了基因/药物时序释放的 目的。 2）相比于游离药物 DOX 组，基因/药物时序联合治疗组降低了乳腺癌细胞 MDA-MB-231 半数抑制浓度 9 倍，同时共聚焦显微镜显示时序治疗组大大增加 了细胞内的药物积累量，通过流式细胞术及免疫荧光实验证实时序治疗可以诱 导细胞色素 C 从线粒体释放至胞浆，诱导细胞凋亡。 3）western blot 证实时序治疗组可引起两方面的细胞凋亡机制，包括细胞膜凋亡 通路 FasL-Fas 和线粒体凋亡 cytochrom C 激活 caspase 家族蛋白表达。 4）游离 DOX 不能抑制裸鼠皮下乳腺癌移植瘤