基因重组fall-39对实验性革兰氏阴性脓毒血症和休克的治疗作用及分子机理的研究-外科学专业论文.docxVIP

基因重组FALL．39对实验性革兰氏阴性脓毒血症 基因重组FALL．39对实验性革兰氏阴性脓毒血症 (休克)的治疗作用及分子机理的研究 研究生 冯新富 导师 陈晓理 教授 摘 要 尽管应用广谱抗生素治疗革兰氏阴性菌感染已取得显著进展，但是 革兰氏阴性脓毒血症和脓毒性休克仍然是住院病人的主要发病和死亡原 因。目前治疗革兰氏阴性菌感染所致的脓毒血症和脓毒性休克依赖于抗 生素控制感染和在危重症监护室矫正心血管，内分泌和其它系统功能失 常的对症支持治疗。然而，尽管抗生素能够快速杀菌，但是它不能保护 实验动物死亡。原因是抗生素不能中和内毒素及一些抗生素能刺激抗生 素破坏的细菌释放过量的内毒素而突发脓毒性休克。已证实抗内毒素单 克隆抗体，IL-1受体拮抗剂，抗氧化剂等许多治疗脓毒血症和脓毒性休 克的措施和制剂在临床上效果差。既抗菌又抗内毒素的疗法对治疗脓毒 血症和脓毒性休克有用，这是因为不但能治疗感染，而且能中和内毒索 的生理效应。昆虫、植物和动物细胞产生的多种小分子抗菌肽起内源性 抗生素的作用，天然免疫中的多种阳离子抗菌肽具备广谱抗菌、抗真菌、 抗原虫、抗病毒和抗肿瘤的活性。FALL．39是Cathelicidin家族中唯一存 在于人体的抗菌肽，主要以无活性的前体存于中性粒细胞的特殊颗粒中， 也出现于其它细胞和血液中。为获取FALL一39肽，先建立它的原核质粒 表达系统，再应用蛋白质纯化技术提纯FALL．39。为探讨它对浓毒血症 和休克的治疗效应，在体外和体内实验中运用BALB／C小鼠模型观察小 鼠的生存时间和存活率。结果：1从人肺腺上皮细胞株SPC．A．1提取总的RNA，用RT．PCR扩 鼠的生存时间和存活率。 结果：1从人肺腺上皮细胞株SPC．A．1提取总的RNA，用RT．PCR扩 增出FALL．39成熟肽的eDNA。建立重组原核质粒pGEX一1^T—FALL ．39表达载体并转染感受态大肠杆菌JMl09。培养转化的大肠杆菌并用 IPTG诱导融合蛋白表达。用溶菌酶和冻溶法裂解细菌。用亲和层析法纯 化和洗脱融合蛋白。凝血酶裂解融合蛋白并产生FALL一39肽。AU电泳图象中能见到FALL一39的单一清晰条带，迁徙条带显示其分子量约 5kDa。用高压液相色谱法收获了550～600ug的高纯化FALL一39肽。2． 体外实验中，FALL一39重组肽能够结合脂多糖，减轻更生霉素致敏的 BALB／C小鼠对脂多糖的致死性。实验组中的平均死亡时间和最长死亡 时间均长于对照组。实验组中的小鼠存活率大于对照组(P80．05)。3．在体 内实验中，FALL．39重组肽能结合脂多糖并减轻脂多糖对更生霉素致敏 的BALB／C小鼠的致死性。实验组中的小鼠存活率大于对照组 (P14o．05，P200．05)。小鼠的存活率与FALL一39的剂量有明显关系 (P24O．05)，当FALL一39的浓度从4．75—5ug／提高到12．5—13，7u∥鼠时， 存活率从62．5％提高到87．5％，内毒素休克小鼠的最长生存时间超过48 小时。4．FALL．39在体内能杀灭革兰氏阴性细菌并能消除头孢他定诱导 的内毒素的活性，保护氯脓杆菌感染的小鼠死亡。尽管头孢他定治疗的 氯脓杆菌感染小鼠的存活率比未治疗组的高，但是两组无统计学意义 (P320．05)，用FALL一39肽的治疗组存活率高于前两个对照组 (P330．05，P340．05)。 结论：在体外和体内实验中，重组n址L．39肽具有抗菌和抗内毒素 活性，能有效地治疗脓毒血症和脓毒性休克，从而保护小鼠死亡。它的 一种分子机制是直接和间接杀灭细菌。另一种分子机制是消除内毒素的 生理效应，这是因为它能够结合快速生长和被抗生素破坏的细菌所释放 的脂多糖，能够结合单核细胞表达的脂多糖受体分子CDl4，抑制细菌性 的脂多糖，能够结合单核细胞表达的脂多糖受体分子CDl4，抑制细菌性 内毒素刺激免疫细胞，并能直接上调和下调免疫细胞的基因表达。因此， FALL-39可能成为治疗革兰氏阴性脓毒血症和脓毒性休克的新药，而 且，分子克隆和蛋白质纯化技术有利于新药的生产。 关键词： FALL一39重组肽 脓毒血症 脓毒性休克 A A Study on Effect of FALL一39 Recombint Peptide on Treating Experimental Gram—negative Sepsis or Septic Shock and Its Molecular Mechanism Master Feng Xin Fu Tutor Prof． Chen Xiao Li Abstract Gram-negative sepsis or septic shock remains a significant cause of mobi