基因芯片平台的建立及在apl细胞分化研究中的应用-遗传学专业论文.docxVIP

上海第二医科大学博士论文基因芯片平台的建立及在APL细胞分化研究中的应用 上海第二医科大学博士论文 基因芯片平台的建立及在APL细胞分化研究中的应用 中文摘要 近年发展起来的基因芯片技术已成为功能基因组学的重要研究工具。为了更 好地在转录组水平研究疾病的发病机制，我们建立了eDNA基因芯片技术平台， 现在已有12，630个克隆，已知基因有9，436个。在平台的质量上，片内和片间的 信号强度的相关系数达到O．95，且芯片的结果与实时定量RT．PCR的结果一致性 好，说明我们的平台是稳定的可靠的平台。 急性早幼粒细胞性白血病(APL)是M3型急性髓性白血病(AML)，特异性 的染色体易位引起RmRot．基因断裂并与其它伙伴基因融合，干扰了维甲酸信号传 导通路，使细胞分化停滞在早幼粒细胞阶段，在药理浓度的全反式维甲酸(ATRA) 作用下，通过与PML—RARer中RARa部分结合，使融合蛋白的构象发生改变，导 致共抑制复合物从PML．RARo,上解离，并进而与共激活复合物结合，解除 PML-RARot对分化相关靶基因的转录抑制效应，促进APL细胞的分化。虽然对 ATRA的作用机制有了一定了解，但维甲酸通路恢复后如何诱导分化的机制仍不清 楚，为了进一步研究维甲酸诱导分化的机制，我们应用eDNA基因芯片技术，结 合自组成图(SOM)与成分平面展示等生物信息学手段，分析了药理浓度的ATRA 诱导NB4细胞分化不同时相(6h、12h、24h和48h)的基因表达谱。通过对受调变 的基因的功能及时相的分析，可以看出ATRA诱导的分化是一个复杂且有序的过 程。在分化的早期，细胞开始退出细胞周期，增殖受到抑制，抗凋亡基因上调； 泛素-蛋白酶体系统被激活，利于PML-RARa的降解和POD结构的恢复。随着细 胞的分化，细胞的杀菌、吞噬和黏附功能逐渐增强，同时促进凋亡的基因上调； 利于分化的细胞进入凋亡。在细胞分化过程中，转录因子起了重要作用。我们着 重分析了C／EBP家族和bHLH家族的转录因子的变化情况，C／EBPa在ATPA作用 后表达略微上升，随着向粒系终末分化表达发生了下降，而C／EBPl3和C／EBPe在 ATPA作用后表达持续上升，它们变化的不同与这些C／EBP蛋白行使的功能不同相 一致a C／EBP8在ATPA作用后表达下降，与文献报道的在粒系分化时上升不一致， 上海第二医科大学博士论文我们推测这可能是由于ATRA效应造成的。bHLH家族成员中的c—mye、OLIG2和 上海第二医科大学博士论文 我们推测这可能是由于ATRA效应造成的。bHLH家族成员中的c—mye、OLIG2和 HESl是分化的负调控蛋白，它们的下调有助于增殖抑制和细胞分化。BHLHB2是 ATRA诱导的基因，它的上调可促进NB4细胞的生长抑制和分化。Idl和Id2在结 构上只有螺旋．环．螺旋的结构域，没有碱性结构域，所以不能和DNA结合，可与 其它bHLH蛋白形成异二聚体抑制它们的功能。Idl和Id2在ATRA诱导的NB4 细胞分化中均是明显上调的基因，我们推测在NB4分化过程中Idl和Id2不是作 为分化的抑制蛋白存在，而是与一些促进增殖或抑制分化的bHLH蛋白结合，减 弱它们的作用，使细胞向中性粒细胞分化。在APL分化过程中已知有多条信号通 路参与，如PKC，JAK／STAT，MAPK和cAMP／PKA途径。我们从多个方面证明 钙信号通路与APL细胞的分化密切相关。参与IP3受体信号途径的基因如Gq蛋 白、磷脂酶C—D和IP3受体表达上升，位于内质网膜上的钙离子通道Polycystin．2 及钙泵SERCA3的上调，位于内质网中的钙储存蛋白钙网蛋白(CALR)和高尔基 体中的钙储存蛋白nucleobindin2表达下降，均促进了胞浆钙离子浓度的上升，特 别是IP3受体信号途径的基因均在早期就发生了改变，说明胞浆中钙离子浓度的上 升是ATRA诱导NB4细胞分化过程中的一个早期反应。已知从内质网释放出来的 钙一部分进入线粒体，使线粒体中钙增加。在分化的后期，随着凋亡信号的增强， 增加的钙可使线粒体膜电位发生改变，释放细胞色素c，激活caspase成员，促进 细胞的凋亡。钙离子还可以通过与一些钙结合蛋白如酪氨酸蛋白激酶2、S100A8、 S100A9、细胞生长调节蛋白11和钙蛋白酶l结合参与细胞分化。细胞的分化必然 伴随着物质和能量代谢的变化。在ATRA诱导APL细胞分化过程中，细胞对葡萄 糖的摄取量减少，对糖的利用从以糖酵解为主向有氧氧化为主转变，氧化磷酸化 加强，同时核苷酸的合成降低，促使细胞退出细胞周期，走向分化。综上所述， 在药理浓度ATRA作用下，APL细胞中的维甲酸受体通路重新被激活，许多基因 的表达发生了变化，这些基因形成了一个复杂且有序的调控网络，最终