孙怡朋-中国农业大学动物医学院.DOCVIP

PAGE PAGE 1 中国农业大学 本科生“URP”立项申请书 项目名称 2017年山东省H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及基因序列分析 申 请 人 孙怡朋 工作单位 动物医学院 联系电话 电子信箱 sypcau@163.com 填表日期 2017 年4月11日 中国农业大学教务处制 项目名称 2017年山东省H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及基因序列分析 项目起止时间 2017.5-2018.4 项目申请人情况 姓名 孙怡朋 性别 女 出生日期 1982年3月 最后学历与学位 博士 专业技术职务 副教授 从事专业 预防兽医学 项目概况 H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛流行，其宿主范围广泛包括鸡、鸭、火鸡、鹌鹑、野鸭、海鸟等多种禽类。在美国北部，大部分海鸟和野鸭体内均能分离到H9N2流感病毒。而在我国，H9N2是鸡群中禽流感病毒的主要亚型，自1992年首次发生以来，给我国养禽业造成了严重的损失。 H9N2亚型禽流感病毒不仅在禽类中广泛流行，部分毒株还能跨越种间屏障继而感染哺乳动物，对我国的公共卫生安全和人类的健康造成巨大的威胁。1998年6至8月，广东省汕头市和韶关市先后从9明流感样病例中分离出H9N2亚型禽流感病毒。这也是全球首次发现H9N2禽流感病毒感染人的病例。1999年3月，香港也发生两例H9N2亚型禽流感病毒感染人的事件。近年来，人的血清学调查结果显示感染H9N2亚型禽流感的人数已经远远超过确诊的H9N2亚型禽流感病例，尽管还没有血清学证据表明该亚型病毒可以在人体内可以建立稳定的体系，但可以看出该亚型病毒已经跨越了人-猪的种间屏障，应高度重视其在人群中流行的潜在可能性。 H9N2亚型禽流感病毒不仅能够直接感染哺乳动物，还可以作为基因供体参与其它亚型流感病毒的重排，从而获得感染人类的更强毒力，继而对人类造成更大的威胁。2003年有两名香港人感染H9N2亚型禽流感病毒，其内部基因与1997年从人体分离的H5N1亚型禽流感病毒有着高度的同源性。该病毒也被认为是H5N1亚型禽流感的基因供体。2013年在我国发生的H7N9亚型流感病毒，在12个月内即造成336人感染，而H5N1在10年内对人的感染病例总和为650例。经研究证实，该病毒全部的内部片段均源自H9N2亚型禽流感病毒。同年在江西发生的H10N8亚型禽流感病毒感染人的事件，该病毒的全部内部基因亦源自H9N2亚型禽流感病毒。因此，加强对H9N2亚型禽流感病毒的流行病学调查和监控，对我国动物流感和人间流感的预警和防控意义重大。 本项目拟对山东省活禽市场的禽类的咽拭子样本进行处理，通过鸡胚的接种进行流感病毒的分离，对分离到的流感病毒进行全基因组的测序并对分离到的H9N2亚型禽流感病毒进行遗传进化分析。通过对其基因片段来源的分析与基因型的划分，初步了解近期H9N2亚型禽流感的遗传变化规律。 二、实施计划及方案(明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法) （一）研究内容： 1.对鸡的拭子和病料进行流感病毒的分离与鉴定。 3.对得到的H9N2流感病毒进行全基因测序以及遗传进化分析。 （二）对培养学生创新能力的具体思路及考核办法： 1.掌握流感病毒分离鉴定的操作方法。考核办法：多人协作完成。 2.对分到的毒株进行全基因测序和遗传进化分析。考核办法：每人独立完成。 3.文章的撰写的技能培训。考核办法：提交基因序列分析报告。 （三）实验方案： 1.病毒的分离与鉴定：将样品充分震荡后取上清，接种在9日龄普通非免疫鸡胚中，37度孵化48小时，收胚检测。在病毒分离中，初代阴性的要进行盲传。通过血凝试验和血凝抑制实验鉴定病毒及其亚型。 2.病毒的全基因测序：收集血凝阳性的鸡胚的尿囊液并利用RNA提取试剂盒进行RNA的提取，设计针对H9N2亚型禽流感八个基因片段的特异性引物，通过PCR的方法扩增相应的片段并进行测序。 3、序列分析：利用mega 6.0软件制作进化树从而进行相应片段的遗传进化分析。 （四）技术路线： 拭子和脏器 拭子和脏器 接种鸡胚 接种鸡胚 阳性尿囊液 阳性尿囊液 毒株鉴定 毒株鉴定 血凝抑制实验血凝试验 血凝抑制实验 血凝试验 公共数据库H9N2的全基因序列的下载 公共数据库H9N2的全基因序列的下载 全基因组序列测定 全基因组序列测定 H9N2病毒的基因进化分析 H9N2病毒的基因进化分析 关键氨基酸位点系统进化