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6^I^LOGUEAbstract 6^I^LOGUE Abstract in Chinese 1 Abstract 8 Symbolic Description l 6 Part I Molucular meehanisms for regulation of hepatocyte CUL4B on HBv replication Chapter I Introduction l 8 Chapter 2 Materials 25 Chapter 3 Methods 27 chapter4 Results 38 ch印ter 5 Discussion 48 Part II Regulation of hepatocyte CUL4B on liver immune microenvironment chapter 1 Introduction 5 l Chapter 2 Materials 53 ch印ter 3 Meth。ds 53 chapter 4 Results 55 chapter 5 Discussion 59 Relerence 60 Acknowledgement 67 Publicati。n 68 万方数据 山东大学硕士学位论文肝细胞CUL4B调控HBV复制和肝脏免疫微环境的作用研究 山东大学硕士学位论文 肝细胞CUL4B调控HBV复制和肝脏免疫微环境的作用研究 硕士生 王博 导师 梁晓红 专业 免疫学 中文摘要 研究背景： 乙肝病毒(HBV)感染是一个全球性的公共安全问题，慢性乙肝病毒感染导致 严重的肝脏疾病，包括失代偿的肝硬化和肝癌等，严重威胁人类健康。我国处于 乙肝病毒感染的高发区，因此阐明HBV的复制机制、发现清除病毒感染、控制疾 病进程的潜在靶点是目前亟待解决的一个重要科学问题。 CUL4B是CUL4B—RING—E3泛素连接酶复合体(CRL4B)的骨架蛋白，能够介导 不同的底物蛋白泛素化修饰，参与调控多种生命活动过程，如：DNA复制和损伤 修复，染色质重塑，细胞周期调控，胚胎发育，造血与生精等。本实验室的前期 结果己证明，CUL4B能够促进HBV的复制，而对于乙肝病毒蛋白是否参与了CUL4B 对HBV复制的调控以及确切机制仍不是很清楚。 同时，肝脏作为乙肝病毒感染的主要靶器官，含有大量免疫细胞，因此也被 认为是一个重要的免疫器官。在HBV感染的过程中，肝细胞本身除直接参与HBV 复制过程外，尚可通过调控肝脏中多种免疫细胞的功能，影响机体清除病毒的免 疫应答水平，与乙肝病毒感染的预后密切相关。因此本课题也对HBV感染模型中 肝细胞CUL4B对局部免疫细胞功能的调节进行了初步探究。 研究目的： 1．研究HBV编码的病毒蛋白在CUL4B对HBV复制调控中的作用及机制。 2．探索肝细胞CUL4B对肝脏免疫功能的调节作用。 万方数据 山东大学硕士学位论文研究方法： 山东大学硕士学位论文 研究方法： 1．肝细胞CUL4B调控HBV复制的机制研究 1．1病毒蛋白Polymerase在CIⅡ．4B调控HBV复制中的作用 1．1．1验证Polymerase蛋白在HBV复制中的作用 构建Polymerase表达缺失质粒pcDNA3一HBVl．1(△P01)。分别将pcDNA3一 HBVl．1(Polymerase蛋白野生型组)、pcDNA3一HBVl．1(△P01)(Polymerase表 达缺失组)、pcDNA3一HBVl．1(AP01)联合pcDNA3一Polymerase(Polymerase拯救 组)转染入HepG2细胞，提取细胞RNA进行RT—PCR，检测HBV pgRNA、收取培养 上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标，验证Polymerase在HBV复制中的作用。 1．1．2分析Polymerase在CUL4B调控对IIBV复制中的作用 将CUL4B过表达质粒或其对照质粒与pcDNA3一HBVI．1、pcDNA3一HBVI．1(△ P01)、pcDNA3一HBVl．1(AP01)联合pcDNA—Polymerase共同转染入HepG2细胞， 提取细胞RNA进行RT—PCR，检测HBV pgRNA、收取培养上清ELISA检测HBsAg等 病毒复制指标，分析Polymerase在CUL4B调控HBV复制中的作用。 1．2病毒蛋白IIBc在CUL4B调控IIBV复制中的作用 1．2．1验证ttBc蛋白在HBV复制中的作用 构建HBc表达缺失质粒pcDNA3一HBVl．1(AHBc)，将pcDNA3一HBVl．1(HBc蛋 白野生型组)、pcDNA3一HBVI．1(AHBc)(HBc表达缺失组)、HBVl．1(AHBc)联 合pcDNA3一HBc(HBc拯救组)共同转染入HepG2细胞，提取细胞