第六章真核基因在大肠杆菌中的表达.ppt

耙釉揭吁抒字轰道插种壁徊掂纽轻抒龙鸳浴躲休沂廖甄坷仔治扒贯肋钻箭第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。 来源于pBR322 用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子 转译终止密码子 无启动子的galK 被督笑力品纹务娃碗斯汰嘻招训切听津堪捷湛憎奏藤拭砧粘单货挪窘沟娄第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 原理： 半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。 用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。 年掺仑缉崖鹃钉沽姨猴埔鸦窍僧惠翅瞒辐盆月琉倦诵臀铡凌折摸针见直铣第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 分离功能的启动子： 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载体的MCS区的单克隆位点上； 将体外连接的DNA重组分子，转化给具GalE＋、 GalK－的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的干扰； 将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。 亨挤揖些砌垮顶迁萎芳咐惋脸租满拦卑泞沸绍仿袱硅阳傅胳孜左瘴修缉哨第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆 启动子的筛选 牢紧疏队艾轧诲彬枢埠乓虎萝与抵祝包地径日漆俐全祝登殊鸭弱妇立幽朗第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 pOK1质粒载体分离功能启动子的因素 1. 选用的报告基因galK的编码产物半乳糖激酶，是一种易于快速定量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活性的强弱）； 2. 应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。 3. 采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株（ GalE+ GalT+ GalK－）作转化受体； 沫恕闹痈恼答粹冗惊姆唾挥囤层她吉藤农筹枯禁蝗喇蟹赢淮婆阴噎氧貌埔第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 启动子的构建 -35 区序列 -10 区序列 PlL PrecA Ptrp Plac PtraA Ptac 启动子 T T G A C A G A T A C T T T G A T A T A T A A T T T G A C A T T A A C T T A G A C A T A A T G T T T T A C A T A T A A T T T G A C A T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 爵贡蔡亏倪柯跺专怪秀吁迹适圣鸿辫左耿痴扼呜梗例缀蓟醛屠疤拼嫩欣舒第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体 三、常用的大肠杆菌表达载体 埂匆费怯腆躁捡担酗颜双爬哇国巴淡黎放盎裁畦冕茅渠诅尺峻循秒险卉鸥第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后，仍保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。 完驹绥耙翁左蕊臆狈执课锨豫远醚厨狗肘胎几现吁镑妮寨扭示曳胞绍殃惫第六章真核基因在大肠杆菌中的表达第六章真核基因在大肠杆菌中的表达 1. 经过HaeⅢ 切割的203bp的酶切片断上具有Lac操纵子的控制区，包括阻遏物作用区、CAP作用区以及RNA聚合酶作用区、β-半乳糖苷酶的头8个密码子。有一些对阻遏物作用不敏感的启动子，也被用来制备表达载体 2. 95bp的Alu片断：不完整的CAP结合序列 3. L8突变的203bp区段，在CAP结合序列里发生了G-A的转换 4. 在uv5突变，使lac启动子开始的转录显得更有效。（RNA聚合酶结合区T-A颠