wisp1通过akt信号通路调控人胸主动脉血管平滑肌细胞增殖和迁移外科学专业论文.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 分子抑制上述二者的活动以抑制细胞凋亡。在神经元缺糖缺氧模型中，WISPl 通过激活Akt信号保护神经元。在促进关节滑膜纤维化过程中，WISPl也是 通过激活Akt信号促使纤维细胞向纤维细胞的分化。 目的 我们由上述背景资料推测：WISPl可能通过与Akt信号通路调节VSMC 的增殖和迁移，从而参与血管再狭窄的发生。本研究拟通过WISPl对于人胸 主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMC)增殖和迁移的作用及相关信号通路的研 究，以试图进一步探寻WISPl对血管平滑肌细胞增殖和迁移的调控机制，为 寻求新的血管再狭窄治疗药物提供科学依据和理论基础，并为药物球囊的设 计提供新的药物靶点。 简言之，本研究的目的为(1)检测血管平滑肌细胞增殖过程中WISPl 的表达关系；(2)检测WISPl蛋白与血管平滑肌细胞增殖和迁移关系；(3) 探索WISPl蛋白调控血管平滑肌细胞增殖和迁移信号通路。 方法 (1)观察在不同浓度血清引起HAVSMC增殖状态下细胞WISPl蛋白 表达水平的影响：在细胞体外培养条件下，使用不同浓度血清(0％FBS、 2％FBS、10％FBS)培养胸主动脉血管平滑机细胞(HAVSMC)48小时后， 使用EdU细胞增殖检测法检测组别间HAVSMC的增殖状态，同时利用 Western blot技术检测WISPl的表达量，统计各组间差异。 (2)构建WISPl在HAVSMC中的过表达及缺失模型并验证：使用腺 病毒转染技术，分别转染含WISPl基因的腺病毒及空载体病毒(MOI=10)， 转染后24小时、48小时在荧光显微镜下拍照，48小时后利用Western blot 技术检测转染病毒后两组细胞中WISPl蛋白的表达水平。 (3)EdU细胞增殖检测方法检测过表达WISPl对细胞增殖变化影响： 转染WISPl过表达腺病毒及空载体病毒后24小时，使用EdU细胞增殖检测 万方数据 中文摘要方法检测转染病毒后两组细胞增殖水平，统计各组间EdU标记阳性细胞个数 中文摘要 方法检测转染病毒后两组细胞增殖水平，统计各组间EdU标记阳性细胞个数 比值差异。 (4)细胞划痕实验方法检测WISPl对细胞迁移的影响：转染WISPl 过表达腺病毒及空载体病毒后24小时，选取5个不同时间点(0小时、6小 时、12小时、24小时、48小时)在显微镜下观察并记录转染病毒后两组细 胞迁移的情况，统计两组间细胞迁移速度差异。 (5)Transwell细胞迁移实验方法检测WISPl对细胞迁移的影响：转染 WISPl过表达腺病毒及空载体病毒后24h，收集细胞接种至Transwell小室上 室(细胞数约为5x104个细胞)，迁移24小时后固定、染色，显微镜下拍照， 统计两组间迁移细胞个数差异。 (6)观察WISPl诱导HAVSMC增殖及迁移的信号通路激活情况：转 染WISPl过表达腺病毒及空载体病毒后24小时，利用Western blot技术检 测Akt，p-Akt的表达量，统计分析p-Akt／Akt比值差异。 (7)验证Akt信号在WISPl诱导HAVSMC增殖及迁移中的作用：转 染WISPl过表达腺病毒及空载体病毒后24小时，使用或不使用Akt抑制剂 AZD5363(浓度=5¨M)处理转染后的细胞，分别使用上述检测增殖和迁移的 方法，观察过表达WISPl后抑制剂对HAVSMC增殖及迁移作用的影响，并 使用Western blot技术检测Akt下游分子p-GSK3／GSK3、MMP9、cyclinDl 蛋白的表达情况。 结果 (1)转染后24小时、48小时在荧光显微镜下观察到转染病毒后两组细 胞均表达绿色荧光，Western blot结果示，转染含WISPl腺病毒的细胞(过 表达WISPl组)中WISPl蛋白的表达水平显著高于转染空载体病毒细胞组 (空载体细胞组)(PO．05)。 (2)经体外贴壁培养细胞48小时后，血管平滑肌细胞的EdU标记阳性 细胞个数比值与血清浓度呈剂量依赖方式增加，对比无血清培养的血管平滑 IV 万方数据 硕士学位论文肌细胞，EdU标记阳性细胞数比值分别增加2．5倍(2％FBS)和3．0倍 硕士学位论文 肌细胞，EdU标记阳性细胞数比值分别增加2．5倍(2％FBS)和3．0倍 (10％FBS)(P0．05)。低血清组细胞和高血清组细胞的WISPl表达水平 明显高于无血清培养细胞，WISPl蛋白表达量分别增加3．4倍(2％FBS)和 4．1倍(10％FBS)，差异有统计学意义(P0．05)。 (3)EdU细胞增殖检测结果显示：转染后24小时，与空载体组细胞相 比，过表达WISPl组的血管平滑肌细胞EdU标记阳性细胞个数比值升高2．98 倍，差异有统计学意义(P0．05)。 (4)细胞划痕实验结果显示：转染后24小时，与空载