葛根素水凝胶在mscs移植治疗心肌梗死中的作用及机制研究心血管内科专业论文.docxVIP

博士学位论文损伤，葛根素有望能够调控干细胞移植后的存活。 博士学位论文 损伤，葛根素有望能够调控干细胞移植后的存活。 如能开发出葛根素类水凝胶进行心肌组织工程治疗，不仅能够为梗塞后心 室提供机械支撑力，包载移植细胞减少细胞的流失，而且可以发挥葛根素抗氧 化保护细胞的作用，进一步增加移植细胞的滞留和存活，使其发挥最大功效。 载药水凝胶的构建一般包括化学键键合和物理包裹的形式，在前者中药物 既成为药物释放的对象又是载体的一部分，能够明显提高药物包载率，但是较 后者在材料的选择和制作工艺上有更高的要求。我们课题组在尝试采用葛根素 键合多肽构建水凝胶的过程中发现，葛根素本身不进行任何的化学修饰就能够 通过简易的工艺和促发方式自组装形成水凝胶。结合葛根素的化学结构及其他 成胶体系的成胶原理，我们推测葛根素水凝胶(Puerarin hydrogel，PG)的成胶原 理可能为：葛根素分子结构中既含有亲水的葡萄吡喃糖结构也有相对疏水的异 黄酮结构，在常温下处于微溶物质，在加热下可以使其完全溶解，冷却时可以 通过分子问苯环堆叠力、疏水作用力和氢键作用自组装形成具有三维纤维网络 的胶体结构。葛根素水凝胶是迄今为止发现的第一种能自己形成小分子水凝胶 的天然药物。葛根素水凝胶的发现具有明显的优势：(1)由于成份只有葛根素 本身，因此其药物包载率是100％，是药物包载率最高的药物载体，其药物释放 是通过胶体的缓慢降解实现；(2)制作工艺和成胶方式简便；(3)通过加热冷 却后约数分钟成胶，为其可注射性斜造条件。接着，课题组对葛根素水凝胶进 行研究，主要包括水凝胶的物理化学性能表征和生物学相容性检测，体外观察 葛根素水凝胶在过氧化环境下保护MSCs的能力，葛根素水凝胶携带MSCs体 内移植大鼠心肌梗死模型的研究。研究分以下三部分进行： 第一部分：葛根素水凝胶的物理化学性能表征和生物学相容性检测 我们对葛根素水凝胶表征时观察到，其最低成胶浓度为l‰并且为均匀的 透明头胶体，随着胶体浓度增高，其透明性有所减弱，6％时形成乳白色的不透 明的水凝胶；通过透射电镜表征水凝胶的自组装形貌：葛根素水凝胶为三维网 络状结构，各个浓度的水凝胶均形成较长的纳米纤维，纤维直径大约为 TIl 万方数据 摘要10．50rim，l％、2％和4％形成的纤维长度及直径均相似；力学性能表征发现， 摘要 10．50rim，l％、2％和4％形成的纤维长度及直径均相似；力学性能表征发现， 葛根素水凝胶是非频率依赖性，而是应力依赖型胶体，2％和4％的葛根素水凝 胶处于稳定状态时的力学强度约为10KPa，这与心肌组织的力学强度相似，适 合进行心肌组织工程研究；体外药物释放实验发现：在生理环境下，2％和4％ 浓度的水凝胶在前12h以较快的速率释放葛根素药物，药物可以持续释放12h 以上；细胞相容性实验表明：CCK-8检测结果显示葛根素水凝胶与心肌细胞和 心肌成纤维细胞均有良好的细胞相容性，无明显细胞毒害作用； 第二部分：葛根素水凝胶在过氧化环境下保护MSCs的能力研究及机制探 讨 本实验采用1001xmol／L n202干预1h作为外源性ROS模拟体内心肌梗死后的 过氧化环境。实验分5组进行：正常MSCs组、H202干预组、H202+2％PG组、 n202+4％PG组和H202+6％PG组。通过检测细胞内的SOD活性、MDA含量和ROS 荧光探针DHE的水平可以反映细胞内ROS的含量，与正常MSCs组比较，H202 干预组细胞#]MDA含量和SOD活性增加，DHE红色荧光数量明显增加，而2％、 4％和6％浓度的葛根素水凝胶可以显著减少SOD活性和MDA含量，DHE红色荧 光明显减少；用CCK-8检测细胞存活和增殖，培养基中LDH的释放反映细胞毒 性的大小，AO／EB染色从细胞形态学上观察细胞的存活和凋亡，Annexin V-FITC／PI双染凋亡检测法检测细胞的凋亡率，这些检测结果表明H202诱导后 细胞存活减少、死亡增加，2％、4％和6％的葛根素水凝胶均可明显降低氧化应 激后MSCs的凋亡率，增加细胞存活：Western blot分析显示2％、4％和6％的葛 根素水凝胶可使抑制细胞凋亡蛋白Bcl．2表达增加和促凋亡蛋I刍Bax和Caspase．3 表达减少，从蛋白水平印证了细胞形态学的变化。这些结果均表明H202诱导细 胞ROS的产生及细胞存活减少、凋亡增多，而通过2％、4％和6％的葛根素水凝 胶培养细胞均可以抑制ROS的产生，保护细胞减少细胞凋亡，其机制可能是通 过减少促凋亡蛋f兰tBax和Caspase一3的表达和增加抑制细胞凋亡蛋[刍Bcl一2的表达 产生作用。 Ⅳ 万方数据 博士学位论文第三部分：葛根素水凝胶在MSCs移植治疗大鼠心肌梗死中的作用及机制 博士学位论文 第三部分：葛根素