东方田鼠非酒精性脂肪肝模型的建立及研究动物学专业论文.docxVIP

复旦火学硕士学位论文 复旦火学硕士学位论文 东方田鼠非酒精性脂肪肝模型的建立及研究 东方田鼠非酒精性脂肪肝模型的建立及研究 摘要 目的： 非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)发病率逐年增高， 且有进展到肝纤维化肝硬化的趋势，目前其确切的发病机制尚不清楚。我们在以 往的实验中发现东方罔鼠有易发脂肪肝的倾向，因此建立东方田鼠非酒精性脂肪 肝模型，利用SMART(Switching Mechanism at 5’end of RNA Transcript， RNA5’端转录机制)技术构建了东方F开鼠肝脏cDNA(complementary DNA， 互补DNA)质粒文库，在此基础上筛选与东方阳鼠脂肪肝发病相关的基因，并获 得其全长序列，为进一步研究非酒精脂肪肝发病机制奠定基础。 方法： 选取105只6周龄洞庭湖种群雄性东方田鼠，随机分成三组，每组35只，分别 为对照组、模型组1和模型组2，各组分别饲喂高纤维料(在大小鼠基础料的基础 上加粗纤维，使粗纤维含量为10％，粗脂肪含量为3％)、高脂料(在大小鼠基础 料的基础上加5％猪油、0．5％胆固醇和0．1％胆盐)、大小鼠基础料。各组分别于造 模开始后第2、4、6、8、12周处死，称量体重及肝重，计算肝指数，采血检测东 方F日鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、 总胆固醇(TC)、碱性磷酸酶(ALP)、游离脂肪酸(FFA)、血糖(GLU)、r-谷 氨酰转移酶(r-GGT)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和胆碱酯 酶(CHE)，并取肝脏HE染色后做病理学观察。通过文献确定，可能与非酒精性 脂肪肝相关的基因，参照NCBI中大小鼠基因cDNA序列的保守区设计其特异性引 物，进行实时荧光定量PCR检测，比较基因动态表达水平。 选取12月龄洞庭湖种群东方田鼠4只，取肝脏组织，提取总RNA，用SMART 技术构建东方田鼠肝脏cDNA质粒文库，测定文库滴度和容量，并随机挑选单 个菌落测序，计算全长基因的比率。 根据实时荧光定量PCR结果确定目的基因，通过PCR方法筛选eDNA质粒文 库，获得目的菌落，用pBluescriptII SK通用引物M13R澳O序，获得基因的全长序 列，并进行序列分析比较。 结果： 模型组1东方田鼠肝细胞均呈现弥漫性脂肪变性，模型组2东方田鼠肝细胞脂 肪变性较轻，对照组东方田鼠肝脏基本正常。 复旦人学硕士学位论文 复旦人学硕士学位论文 东方田鼠非酒精性脂肪肝模型的建立及研究 与对照组相比，模型组l肝重和肝指数都明显升高(P0．05)，血清ALT、 AST、TC、FFA、r-GGT、LDL、CHE和GLU都明显升高(P0．05)，HDL 和TG均明显降低(P0．05)，ALP无明显差异(P0．05)；对8个基因进行 了实时荧光定量PCR结果显示肝组织中的CYP2El(细胞色素P4502E1)、ECHSl (烯酰辅酶A水合酶短链1)、CYP2D5(细胞色素P4502D5)、CYP2a3a(细 胞色素P4502a3a)和PGC．1(过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子1)这5 基因表达上调(P0．05)，SC4MOL(固醇甲基氧化酶)、Adipor(脂联素受体) 和AMPK-1(腺苷酸活化激酶．1)这3个基因表达下调(尸O．05)。 与对照组相比，模型组2肝重和肝指数明显升高(尸O．05)，血清FFA、 LDL、CHE显著升高(P0．05)，HDL明显降低(PO．05)，其余指标与对 照组相比无显著差异；实时荧光定量PCR结果显示所测基因未有明显改变(JP 0．05)。 利用SMART技术构建了东方田鼠肝脏eDNA质粒文库，该eDNA文库滴度 为1076 p纠“L，重组率约94％，库容量达1．08×106。测定了22个克隆序列经 BLAST分析，与GenBank中大鼠、小鼠、田鼠以及人类己知功能蛋白具有75％ 以上的同源性，基因完整性比率为77．3％。 克隆了CYP2E1、CYP2D5、ECHSl三个基因，并获得了它们的全长eDNA 序列。CYP2E1基因eDNA全长为1685bp，有1482bp的完整开放阅读框，编 码494个氨基酸；CYP2D5基因eDNA全长为1690bp，有1514bp的完整开放 阅读框，编码504个氨基酸；ECHSl基因eDNA全长为1013bp，有873bp的 完整开放阅读框，编码290个氨基酸。这三个基因的核酸序列及其推测的氨基酸 序列与人、大小鼠序列高度同源。在GenBank中注册号分别为GQ507485、 GQ507486、CQ845 1 71。 关键词：东方用鼠，非酒精性脂肪肝，动物模型，cDNA文库，eDNA序列 中图分类号：Q